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当期目录

    2018年 第51卷 第15期 刊出日期:2018-08-01
      
    《中国农业科学》2018年第51卷第15期目次
    中国农业科学. 2018, 51(15):  0-0. 
    摘要 ( 13 )   PDF (322KB) ( 34 )   收藏
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    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析
    赵婉莹,于太飞,杨军峰,刘沛,陈隽,陈明,周永斌,马有志,徐兆师,闵东红
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2835-2845.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.001
    摘要 ( 45 )   HTML ( 6 )   PDF (947KB) ( 64 )   收藏
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    【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白GmbZIP16,对其进行功能验证,确定GmbZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白GmbZIP16,以大豆cDNA为模板克隆获得GmbZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和qRT-PCR分析,确定GmbZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度(6% PEG和8% PEG)的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用qRT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转GmbZIP16大豆毛状根复合体施加25% PEG处理1周后,分别采取转GmbZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的GmbZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转GmbZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量(鲜重和根长)及存活率比野生型显著提高。在过表达GmbZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转GmbZIP16大豆毛状根复合体植株在25% PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转GmbZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆GmbZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达GmbZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。GmbZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。
    基于SSR标记的黍稷种质资源遗传多样性及亲缘关系研究
    薛延桃,陆平,乔治军,刘敏轩,王瑞云
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2846-2859.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.002
    摘要 ( 56 )   HTML ( 4 )   PDF (1950KB) ( 60 )   收藏
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    【目的】利用SSR标记,分析黍稷种质资源(野生材料和地方品种)的遗传多样性水平,揭示不同来源黍稷种质资源的亲缘关系和遗传群体结构差异,为黍稷起源进化研究奠定基础。【方法】用6份地理差异显著的黍稷种质资源对137对小宗作物课题组开发的具有多态性的SSR引物进行初步筛选,最终筛选103对条带清晰、扩增良好且多态性稳定的SSR引物,利用这103对多态性SSR标记对146份黍稷材料进行PCR扩增,通过遗传参数、聚类、遗传结构等分析,评估不同个体间及不同群体间的遗传多样性,探讨遗传结构差异。【结果】103对SSR标记共检测出308个等位基因(Na),平均值为2.99,平均Shannon-Weaver指数(I)为0.8478,平均期望杂合度为0.3642,平均多态性信息含量指数(PIC)为0.5544。103对SSR标记的分布区间为0—1、1—2、2—3、3—4和4—5,分辨率范围为0.334—4.002,77.67%的标记分布于区间1—4,具有适度分辨力。国内资源的观测等位基因数(2.9126)、多样性指数(0.8302)、期望杂合度(0.5023)、多态性信息含量指数(0.5278)均高于国外资源,遗传多样性更丰富。12个群体的遗传距离的变化范围为0.0783—0.5762,均值为0.2938;遗传一致度变化范围为0.5620—0.9247,均值为0.75,遗传相似性与地理分布具有一定相关性,地理分布越近,遗传距离越小,遗传一致度越高。聚类分析在遗传距离为0.15处可以把12个群体分为4个组群,其中南美洲和山西资源各自独立分为一支,与其他资源亲缘关系较远。个体间聚类中,国内外资源划分非常显著,在遗传距离为0.63处,146份黍稷资源可分为3大组群,组群Ⅰ和组群Ⅱ为国外资源,组群Ⅲ为国内资源。组群Ⅱ在遗传距离为0.39处又分为3个亚群,组群Ⅲ在遗传距离为0.45处分为5个亚群,其中亚洲与欧洲资源、中国河北与中国山西、中国内蒙古资源的遗传关系较近。遗传结构分析结果显示国内外群体间存在明显的遗传分化,其中5个组群(组群2、组群5、组群6、组群7和组群9)为国内野生资源特有基因型,分布较为分散;2个组群(组群1和组群4)为国外资源特有基因型,分布较为集中。中国宁夏、南美洲资源的群体结构趋向单一化,中国河北、中国黑龙江、亚洲资源的群体结构趋向多元化。UPGMA聚类结果与遗传结构分析结果一致,且不同地区黍稷资源群体间遗传关系远近均与其地理分布相关。【结论】野生资源的遗传多样性高于国外资源,其中中国河北群体的遗传多样性最丰富,中国河北可能是黍稷的起源中心。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    旱地麦田深松蓄水和覆盖播种土壤水分变化与小麦籽粒蛋白质含量的关系
    张慧芋,孙敏,高志强,梁艳妃,杨清山,张娟,李念念
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2860-2871.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.003
    摘要 ( 34 )   HTML ( 6 )   PDF (414KB) ( 59 )   收藏
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    【目的】明确旱地麦田休闲期深松蓄水和覆盖保水的技术效果,有利于探索旱地小麦增产提质的最佳耕作及覆盖播种技术新途径。【方法】于2012—2014年度在山西农业大学闻喜小麦试验基地开展大田试验,以休闲期深松和当地传统耕作为主区,以全膜覆土穴播、膜际条播、常规条播为副区,研究深松和覆盖播种对3 m内土壤水分、小麦籽粒蛋白质含量及其产量的影响。【结果】旱地麦田休闲期深松处理播种至开花期0—300 cm土层蓄水量较免耕处理显著提高,产量提高12%—30%,且籽粒谷蛋白含量、蛋白质产量显著提高。两覆盖播种较常规条播,土壤蓄水量越冬至开花期均显著提高,产量提高6%—24%,籽粒醇溶蛋白、总蛋白含量及蛋白质产量显著提高,清蛋白提高。深松条件下,膜际条播较全膜覆土穴播开花期土壤水分显著降低;免耕条件下,两覆盖处理间各生育时期土壤水分差异不显著。膜际条播较全膜覆土穴播产量提高,在2012—2013深松条件和2013—2014免耕条件下差异显著。深松条件下,膜际条播较全膜覆土穴播籽粒蛋白质组分含量,总蛋白质含量及其产量显著提高。此外,相关性分析表明,开花期0—100、100—200、200—300 cm土层土壤蓄水量通过直接与间接作用对籽粒蛋白质积累的总影响均表现为正向作用,且2012—2013年100—200 cm土层土壤水分对籽粒蛋白质含量的提高贡献最大,2013—2014年200—300 cm土层土壤水分对籽粒蛋白质含量的提高贡献最大。从籽粒蛋白质产量形成的贡献来看,休闲期深松主要通过影响开花期土壤水分影响籽粒蛋白质产量,且深松条件下覆盖播种主要是通过影响孕穗期土壤水分而影响籽粒蛋白质产量,且膜际条播对蛋白质产量的贡献显著大于全膜覆土穴播。【结论】休闲期深松有利于蓄积休闲期降雨,覆盖播种有利于保蓄土壤水分,其效果延续至开花期,而生育中期土壤水分与籽粒蛋白质积累密切相关,休闲期深松配套膜际条播覆盖播种有利于旱地小麦产量和品质协同提高。
    不同方式周年覆盖对黄土高原玉米农田土壤水热的调控效应
    吴杨,贾志宽,边少锋,王永军
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2872-2885.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.004
    摘要 ( 29 )   HTML ( 2 )   PDF (617KB) ( 69 )   收藏
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    【目的】探究黄土高原半干旱区不同覆盖方式调控土壤水、热与持续增产、增效的协同效应,为该区确立高效、环保覆盖方式提供理论依据。【方法】设置塑料地膜全膜覆盖(PM)、降解膜全膜覆盖(BM)、膜垄种植(RH)和秸秆覆盖(SM)4种不同周年覆盖(休闲期+生育期)方式,以裸地不覆盖为对照(CT),通过3年大田定位试验,研究不同覆盖方式对土壤水、热时空动态变化规律及其利用特征的影响。【结果】周年覆盖能有效抑制休闲期土壤水分无效蒸发,提高降水潜在利用效率,PM、BM、RH和SM处理休闲期分别较CT多储水53、51、32和36 mm,降水潜在利用效率分别提高了14%、12%、11%和10%。地膜覆盖增温显著,有效提高了玉米干物质累积速度,缩短了其生育进程,其中PM、BM和RH处理拔节期分别较CT提前了15、8和 7 d,成熟期分别提前了17、7和7 d。与CT处理相比,PM、BM和RH处理产量增幅分别为52%、32%和27%,积温生产效率分别提高了57%、15%和58%,水分利用效率分别提高了31%、14%和26%,降水利用效率分别提高了53%、27%和29%,耗水系数则分别降低了33%、21%和22%。SM处理能有效增加玉米生育期土壤储水量,但土壤温度的降低导致其生长发育迟缓,其拔节期和成熟期分别较CT推迟了4 d和5 d,最终产量、水分生产效率和积温生产效率分别降低了21%、18%和9%。PM处理增加了农田耗水量,其季末供水能力分别较BM、RH和SM降低了19、56和86 mm。但PM处理土壤水分平衡受生育中后期降水量影响较大,2015 年 7—9 月降水量较多年平均值减少71 mm,PM处理收获期100—200 cm土层土壤储水量较CT处理减少28 mm,并较土壤稳定度降低5.4 mm,造成深层土壤水分亏缺。【结论】塑料地膜全膜覆盖是黄土高原半干旱区协同提高土壤水、热资源利用效率,增加玉米产量的有效措施,然而在玉米生育中后期遭遇干旱容易引起深层土壤水分亏缺和产量波动;降解膜全膜覆盖和膜垄种植处理的增温和增产效果均弱于塑料地膜全膜覆盖,但更有利于维持土壤水分平衡;秸秆覆盖降温、减产效果明显,不推荐在气温较低的半干旱区应用。
    基于数码相机的玉米冠层SPAD遥感估算
    贺英,邓磊,毛智慧,孙杰
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2886-2897.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.005
    摘要 ( 24 )   HTML ( 1 )   PDF (5180KB) ( 77 )   收藏
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    【目的】叶绿素是植物光合作用中重要的色素。利用作物光谱信息对叶绿素含量进行反演,为作物的实时监测和生长状态诊断提供重要依据。【方法】以大田环境下不同氮肥水平(0,50%和100%)的开花期玉米为研究对象,利用轻小型无人机搭载数码相机,获取试验区RGB影像。使用土壤调整植被指数(soil adjusted vegetation index,SAVIgreen)对图像进行分割,基于分割前后的影像分别提取15种常见的可见光植被指数,综合分析指数与玉米冠层叶绿素相对含量SPAD值的相关关系。采用单变量回归模型、多元逐步回归模型和随机森林(random forest,RF)回归算法构建玉米SPAD值的遥感估算模型,通过模型精度评价指标决定系数(coefficient of determination,R2)、均方根误差(root mean square error,RMSE)、平均相对误差(mean relative error,MRE)和显著性检验水平(P<0.01),确定最佳指标和最优模型。【结果】基于分割前后的数码影像提取的VIplot和VIplant植被指数与玉米冠层SPAD值之间具有显著的相关关系,其中VIplant中的红光标准化值(NRI)、归一化叶绿素比值植被指数(NPCI)、蓝红比值指数(BRRI)、差值植被指数(DVI)与SPAD值的相关性在0.77以上;以相关性高于0.77的VIplant指数NRI、NPCI、BRRI、DVI构建的线性、指数、对数、二次多项式、幂函数的单变量回归模型中,NRI指数构建的二次多项式模型效果最好,决定系数R2为0.7976,RMSE为4.31,MRE为5.91%。在VIplant指数NRI、NPCI、BRRI、DVI参与建立的多变量SPAD反演模型中,使用随机森林方法的模型精度最高,决定系数R2为0.8682,RMSE为3.92,MRE为4.98%,而多元逐步回归模型的精度高于任意单变量回归模型,决定系数R2为0.819,RMSE为4,MRE为5.67%;对数码影像结合各模型制作的SPAD分布图进行精度分析,使用随机森林回归模型对SPAD的估测值与实测值最为接近,具有最佳的预测效果,R2为0.8247,RMSE为4.3,MRE为5.36%,可以作为玉米冠层叶绿素信息监测的主要方法。【结论】本研究证明将数码相机影像提取的可见光植被指数应用于玉米叶绿素相对含量的估测是可行的,这也为无人机遥感系统在农业方面的应用增添了新的手段和经验。
    植物保护
    我国黄淮麦区10个短体线虫样品种类的分子鉴定
    刘海璐,王暄,李红梅,李艳霞,薛博文,马居奎
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2898-2912.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.006
    摘要 ( 22 )   HTML ( 2 )   PDF (1438KB) ( 59 )   收藏
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    【目的】短体线虫(Pratylenchus spp.)是植物根系内迁移性寄生线虫,可引起许多作物的根腐线虫病,给世界农业生产造成了极大的危害。为明确我国黄淮麦区与禾谷孢囊线虫复合侵染小麦的短体线虫种类,本研究对采自黄淮4省麦区的10个短体线虫样品进行种类的分子鉴定,分析种群系统进化关系及种内遗传变异,以期为我国小麦根部线虫病害的综合防治提供指导。【方法】对采自江苏、安徽、河南和山东4省小麦孢囊线虫发病田中的10个小麦短体线虫样品进行线虫分离,从各样品中随机挑取5条短体线虫,分别提取单条线虫DNA,扩增rDNA 18S片段并进行测序比对,选取序列有代表性的2个DNA样本进一步扩增其rDNA 28S D2-D3区以及mtDNA-COI基因片段,经序列比对分析后,利用MEGA4.0软件采用邻接法分别构建基于rDNA 18S、28S D2-D3和mtDNA-COI序列的系统进化树,通过聚类关系及相似度分析确定线虫种类,同时利用种特异性引物进行验证。【结果】扩增挑取的50条短体线虫的rDNA 18S区片段,测序得到片段长度在857—935 bp,BLAST比对分析揭示部分样品可能为短体线虫的混合种群;进一步测定的20个代表性DNA样本的rDNA 28S D2-D3区和mtDNA-COI基因的片段长度分别在771—784 bp和415—417 bp;系统进化树以及相似度分析揭示我国黄淮流域4省麦区10个短体线虫样品中有咖啡短体线虫(P. coffeae)、落选短体线虫(P. neglectus)和斯克里布纳短体线虫(P. scribneri),其中,江苏沛县样品JS2和山东潍坊样品SD1是落选短体线虫单一侵染样品,河南永城样品HN2和安徽淮北样品AH3是咖啡短体线虫单一侵染样品,安徽萧县样品AH2、AH5和淮北样品AH4以及河南永城样品HN1和HN3均为落选短体线虫和咖啡短体线虫的混合侵染样品,江苏徐州样品JS1是落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫的混合侵染样品。用SCAR特异性引物扩增20个短体线虫单条DNA样本,结果显示,用落选短体线虫特异性引物PNEG-F1/D3B5能够从JS1-2、JS2-1、JS2-2、AH2-2、AH4-1、AH5-1、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2等10个样本中扩增出140 bp的单一条带,用咖啡短体线虫引物PC1/PC2能够从AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1等9个样本中扩增出630 bp的单一条带,用斯克里布纳短体线虫引物PsF7/PsR7从JS1-1中扩增出130 bp的单一条带,种类鉴定结果与上述序列分析结果相一致。【结论】我国黄淮流域4省小麦孢囊线虫发病田中的短体线虫种类有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫,其中落选短体线虫是优势种,证实了短体线虫不同种群复合侵染小麦的现象较为普遍。基于mtDNA-COI基因构建的系统进化树可以有效区分短体线虫的近缘种,相比rDNA 18S和28S基因更适于作为短体线虫种类鉴定的分子靶标。
    中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定
    甄浩洋, 彭焕, 孔令安, 洪豹元, 朱桂兰, 汪锐辉, 彭德良, 文艳华
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2913-2924.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.007
    摘要 ( 31 )   HTML ( 4 )   PDF (5275KB) ( 96 )   收藏
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    【目的】在江西婺源县孢囊线虫调查中,从大豆根及根际土壤中采集到一个孢囊线虫群体,其形态特征和分子特征与大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)存在较大差异,因此对其形态学和分子特征以及寄生性等进行详细研究,以明确其种类及对豆科作物寄生性,为病害防控提供科学依据。【方法】从婺源县采集的大豆根及根际土样,用筛淘法分离孢囊,大豆根系上的孢囊用直接解剖法获取。用浅盘法分离根际土样中的2龄幼虫和雄虫。选取具典型特征的饱满孢囊制作阴门锥切片,浅盘法分离的2龄幼虫和雄虫制作永久玻片,在显微镜下观察记录孢囊、2龄幼虫和雄虫的形态特征,并进行形态特征测量。采用两对植物线虫通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分别扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和28S大亚基D2-D3区段,经序列测定,用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining(NJ)method)构建该线虫群体与孢囊线虫属其他种群的ITS和LUS D2-D3系统进化树,分析其系统发育关系。在温室内采用盆栽人工接种的方法,测定江西孢囊线虫群体对11种豆科作物的寄生性,同时测定国内40个大豆栽培品种对该孢囊线虫的抗病性。【结果】形态学观察和特征值测量结果表明,从江西婺源大豆上采集的孢囊线虫群体,其孢囊形态、2龄幼虫以及雄虫的形态特征与野生豆孢囊线虫(Heterodera sojae)的形态特征基本一致;ITS序列(MG859982)比对发现其与野生豆孢囊线虫ITS序列(KU160510和KU160512)的同源性为99%和98%,而与大豆孢囊线虫ITS的同源性仅为81% (KY794762.1)。D2-D3序列(MG859981)与野生豆孢囊线虫(KU160511)相似度最高,为99%。序列系统进化树分析发现以ITS序列与D2-D3序列构建系统发育树的结果相一致,江西孢囊线虫群体与野生豆孢囊线虫分布在同一支,节点支持率为100%,而与大豆孢囊线虫聚在另一个分支中。结合形态学和分子生物学结果,将江西婺源大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种。寄生性研究结果表明,在参鉴的11种豆科作物中,野生豆孢囊线虫的2龄幼虫能在大豆和相思豆(红豆)上侵染和繁殖,完成生活史;虽然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8种作物根系,但不能完成生活史。测定的40个大豆栽培品种中,19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。【结论】在我国江西婺源新发现的一种寄生于大豆的孢囊线虫为野生豆孢囊线虫, 系中国新记录种;人工接种条件下相思豆(红豆)也是野生豆孢囊线虫的寄主,40个大豆栽培品种中30个对该孢囊线虫表现感病。
    氯虫苯甲酰胺干扰桃小食心虫交配的转录组分析
    孙丽娜,田志强,张怀江,李艳艳,闫文涛,岳强,仇贵生
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2925-2936.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.008
    摘要 ( 22 )   HTML ( 2 )   PDF (536KB) ( 54 )   收藏
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    【目的】探明氯虫苯甲酰胺处理后桃小食心虫(Carposina sasakii)成虫的转录组差异,了解该药剂影响桃小食心虫交配的基因在功能分类和代谢通路等方面的生物学特征,挖掘与交配相关的功能基因。【方法】通过生物学实验观察氯虫苯甲酰胺干扰桃小食心虫成虫交配及繁殖情况。采用Illumina HiSeqTM2500高通量测序技术对刚羽化的桃小食心虫雌雄成虫、羽化后4—6 h进入交配高峰期的雌雄成虫和经氯虫苯甲酰胺处理4—6 h的雌雄成虫进行转录组测序,利用Trinity软件对所得序列进行de novo组装及评估,之后对获得的有效序列进行功能注释,并利用qRT-PCR技术分析氯虫苯甲酰胺处理后相关基因的时空表达变化。【结果】氯虫苯甲酰胺处理后,桃小食心虫的交配率显著降低,寿命缩短,产卵量减少。通过合并组装桃小食心虫转录组有效序列共获得102 831条unigene,其中34 526个有注释信息。根据筛选标准,氯虫苯甲酰胺处理过程中,雌雄虫中分别有122个和147个基因发生变化,其中相同差异基因31个。对所存在的234个差异基因进行GO功能注释和富集分析结果显示,分子功能过程中的催化活性和结合活性及生物学过程中与代谢过程、单一生物体过程和细胞过程相关的5类基因占主导地位。KEGG分类结果显示,富集到代谢通路的最多,有25个,包括昆虫激素合成、药物代谢等。通过比对分析,鉴定c64662.graph_c0为桃小食心虫鱼尼丁受体基因,其长度为15 637 bp,与已报道CsRyR的一致性为99.0%。此外,在234个差异基因中,鉴别羧酸酯酶unigene 3个、细胞色素P450 unigene 4个、肌钙蛋白unigene 3个、气味结合蛋白unigene 1个和生物钟unigene 1个。细胞色素P450 c40709.graph_c0参与昆虫激素生物合成。根据转录组中基因表达分析,12个基因在雌雄虫中的表达均出现不同变化趋势。qRT-PCR结果显示,氯虫苯甲酰胺诱导羧酸酯酶c51998.graph_c0基因上调表达;药剂处理后,雌雄虫的c57480.graph_c0和c53794.graph_c0的表达分别呈现显著的上调和下调变化,而c40709.graph_c0基因仅在雄虫中显著下调,处理6 h后c53281.graph_c0只在雌虫中上调表达;氯虫苯甲酰胺处理后3个肌钙蛋白基因在整个试验阶段均表现明显的下调趋势;雄虫中的生物钟unigene c60883.graph_c0和气味结合蛋白unigene c45675.graph_c0的变化趋势较为一致,进入暗期后立即上调,但均受氯虫苯甲酰胺的抑制。雌虫体内RyR的表达量显著上调,而雄虫初次到达求偶高峰期前RyR的表达量与对照差异不显著,到第2个求偶高峰期时,RyR表达显著下调。除细胞色素P450 c57480.graph_c0、c40709.graph_c0和c53281.graph_c0外,其余基因在雄虫中的表达均高于雌虫。且触角酯酶基因c54944.graph_c0、生物钟基因c60883.graph_c0和气味结合蛋白基因c45675.graph_c0在黑暗光照交替变化时,表达发生明显地上调或下调。【结论】通过转录组测序发现氯虫苯甲酰胺干扰桃小交配的作用机制是由靶标基因、嗅觉相关基因、代谢基因、生物钟基因等相互作用引起的。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    农田合理施氮量的推荐方法
    张亦涛,王洪媛,雷秋良,张继宗,翟丽梅,任天志,刘宏斌
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2937-2947.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.009
    摘要 ( 25 )   HTML ( 1 )   PDF (695KB) ( 84 )   收藏
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    为了实现作物高产的同时降低氮素环境污染风险,确定农田合理施氮量是最有效的方法之一。作者在阐明氮肥合理施用概念及中国氮肥施用现状的基础上,系统分析了国内外氮肥合理施用量的主要推荐方法,包括:基于土壤测试的推荐方法、基于氮肥施用效应函数的推荐方法、基于氮素输入输出平衡的推荐方法以及基于淋溶水硝态氮超标临界值的推荐方法等4种。前3种方法首先关注氮素农学效应其后评价环境效应,以获得较好的农学效益为出发点,具有一定的科学性,在实践中也证明了其适用性。第4种方法首先考虑氮素环境效应然后评价其对产量影响,以确保地下水硝态氮含量不超标为直接目标,能够量化氮肥合理施用量的实际环境效应,但淋溶水硝酸盐超标临界施氮量的确定由于受多种因素的影响而存在一定的不确定性,其在年际间、区域间、土壤类型间的变异程度均有待进一步研究。
    长江流域农民习惯施肥与推荐施肥的冬油菜产量与养分效率差异分析-基于大样本田间试验
    朱芸,徐华丽,张洋洋,任涛,丛日环,鲁剑巍
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2948-2957.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.010
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    【目的】合理施肥是保证和维持油菜产量的关键。面对目前集约化的种植管理模式,肥料的粗放管理和施用势必造成养分效率的下降,从而影响油菜产量。本研究通过比较长江流域冬油菜种植区域农民习惯施肥与推荐施肥的产量和养分利用效率差异,为冬油菜肥料合理施用、提高肥料利用效率提供策略。【方法】选取2005—2016年长江流域(包括四川、贵州、湖北、湖南、安徽、江苏和浙江7个省份)的535个油菜田间试验,分析不施肥(CK)、农民习惯施肥(FP)和推荐施肥(RF)处理间以及长江流域各区域间的油菜产量和产量分布特征,比较不同施肥处理的增产效果,以及氮、磷、钾肥料用量和偏生产力的差异,计算RF处理与FP处理间施肥量的差值,评估长江流域氮、磷、钾肥的减施潜力。【结果】长江流域CK处理冬油菜产量主要分布在500—1 500 kg·hm-2,FP处理主要分布在1 500—3 000 kg·hm-2,RF处理最高,集中在2 000—3 000 kg·hm-2,土壤基础地力对RF处理油菜产量的贡献率为45.1%—49.7%;3个不同处理在区域间油菜的平均产量均表现为长江下游>中游>上游。长江上、中、下游FP处理油菜产量均值分别为2 033、2 182和2 542 kg·hm-2,RF处理油菜产量较FP分别增产16.7%、16.5%和13.9%,增产点比例达77.5%—94.9%。随着地力水平的提升,各个处理油菜增产率均表现出逐渐下降的趋势,RF处理在不同地力水平下亦呈现出明显的优势。比较RF与FP处理施肥量发现,长江流域FP处理施肥量均值为162.5—239.5 kg N·hm-2、58.6—82.0 kg P2O5·hm-2和45.5—60.8 kg K2O·hm-2,而RF处理施肥量均值则为162.2—233.6 kg N·hm-2、67.2—94.1 kg P2O5·hm-2和73.6—108.5 kg K2O·hm-2,两种施肥处理氮肥用量未表现出显著的差异,FP处理磷、钾肥用量偏低。与RF处理相比,PF处理氮肥可减施的点位比例最大,长江流域45.6%的点位能够减氮,25.6%的点位可以减磷,钾肥减施点位的比例仅为13.2%。同时,需要增施氮、磷、钾肥的比例分别为37.8%、60.0%和75.9%。区域间肥料用量以长江下游适宜点位比例最大,氮、磷、钾肥适宜用量的点位比例分别为25.0%、22.8%和17.1%。长江流域FP处理的氮、磷、钾肥偏生产力均值分别为11.1—14.2、28.6—45.8和38.3—47.6 kg·kg-1。RF在FP处理的基础上提高了氮肥偏生产力12.9%—15.9%,但与其他发达国家相比仍处于较低水平;而RF处理的磷、钾偏生产力与FP相比有所下降,平均降低幅度分别为6.9%和19.6%,也表明目前推荐的施肥量仍然存在减肥的空间。【结论】与农民习惯施肥相比,推荐施肥显著增加了油菜产量,且农民习惯的肥料用量存在较大的调整空间。
    园艺
    番茄果实成熟过程中SlSWEET7a的功能分析
    程杰,张新圣,李安琪,姜晶
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2958-2968.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.011
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    【目的】SWEETs(sugars will eventually be exported transporters)是一种糖转运蛋白,参与植物生物进程,对植物生长发育、响应各种胁迫、宿主-病原体的互作发挥作用。克隆番茄SWEET7a,通过构建SlSWEET7a沉默和过表达载体,研究其在糖的转运过程中的作用,为探索SWEETs在植物果实发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以Micro-Tom(Solanum lycopersicum)番茄为试材,利用RT-PCR技术从果实中克隆SWEET7a的cDNA全长842bp,进行生物信息学分析,并利用MEGA6.0构建拟南芥进化树,与SlSWEET7a进行蛋白序列同源性分析;利用实时荧光定量PCR技术探明其在果实发育时期的时空表达特征分析,并构建基因的沉默和过表达载体,通过农杆菌介导的果实注射法进行瞬时表达检测构建载体的表达效率;然后进行番茄的遗传转化,获得T1代转基因株系,利用实时荧光定量PCR技术检测绿熟期果实SWEET7a的表达,通过高效液相色谱法检测转基因果实和叶片中糖组成与含量的变化。【结果】SlSWEET7a蛋白结构是由7个跨膜结构域构成的。同源性比对分析结果显示,SlSWEET7a与拟南芥AtSWEET6和AtSWEET8序列同源性较高,都属于SWEETs家族的CladeⅡ。番茄果实各部位的表达分析显示,SlSWEET7a在绿熟期果柄、果实维管束相对表达量最高,转色期和红熟期相对表达量较低。构建SWEET7a沉默(S7a)及过表达载体(OE7a)在番茄果实的瞬时表达,发现OE7a样品果实中SlSWEET7a的表达量是未注射果实的6倍,其SlSWEET7a表达量明显上调,与对照相比,S7a样品果实中SlSWEET7a明显下调了5倍。在番茄中的遗传转化中卡那霉素抗性筛选获得10株可能的超表达T0代植株,PCR鉴定得到了SlSWEET7a超表达8株;沉默株系经除草剂筛选,获得14株,PCR检测得到10株沉默株系。T1代植株的实时定量分析显示,过表达SlSWEET7a植株发生转基因沉默现象,SlSWEET7a表达量显著低于正常植株,而沉默植株表达量也降低,说明获得的过表达植株也发生了基因沉默。果糖、葡萄糖和蔗糖含量测定结果表明,降低番茄中SlSWEET7a的表达,植株成熟叶片和绿熟期果实中果糖、葡萄糖和蔗糖含量均高于对照,尤其是叶片中蔗糖含量显著高于对照,这说明SlSWEET7a对细胞中蔗糖的易化扩散起着重要作用。【结论】SlSWEET7a对叶片中蔗糖向源组织韧皮部的装载及果实果柄、维管束的运输、卸载起重要调控作用。
    柑橘品种鉴定的SSR标记开发和指纹图谱库构建
    李益,马先锋,唐浩,李娜,江东,龙桂友,李大志,牛英,韩瑞玺,邓子牛
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2969-2979.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.012
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    【目的】筛选出一套SSR核心引物,用于构建柑橘品种的DNA指纹图谱库,为柑橘种苗认证、品种登记和植物新品种保护提供技术支撑。【方法】以柑橘属8个主要栽培种类为试材进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出多态性丰富、扩增条带稳定的引物对部分参试品种进行PCR扩增,扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步的引物筛选;筛选得到的引物进行荧光标记,并选用部分柑橘品种进行PCR扩增,扩增产物利用基因分析仪检测,分别计算各引物的PIC值、等位基因数目,选取一套多态性丰富的适合进行荧光毛细管电泳检测的SSR引物组合,进而对所有参试品种进行分析,构建柑橘品种的DNA指纹图谱库,同时利用筛选的SSR标记对参试品种进行鉴定。【结果】初期以柑橘属8个种的代表品种(太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大红甜橙、邓肯葡萄柚、枸橼、费米耐劳柠檬和墨西哥来檬)为材料,用362对SSR引物进行PCR扩增,扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳检测,初步筛选出80对种间多态性高、扩增稳定的SSR引物;进一步从8个种类里选择不同类型的64个柑橘品种,用上述筛选出的80对SSR引物进行PCR扩增,扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,再筛选出60对品种类型间多态性高、扩增稳定、条带清晰的SSR引物,并分别进行荧光标记;另以168份柑橘品种为材料对上述60对SSR引物进行PCR扩增,经荧光毛细管电泳检测,依据各引物的PIC值、等位基因数目、峰图读取难易程度、扩增稳定性及染色体位置等,最终筛选出21对SSR引物作为指纹图谱库构建的核心引物。为消除不同仪器、不同试验批次等引起的误差,为21对SSR引物各主要等位变异选择相应的参照品种。根据各引物标记的荧光颜色及扩增片段大小进行合理组合,21对SSR引物可分成5组进行多重电泳,共采集500份柑橘品种的DNA指纹。利用SSR标记,有111份品种仅用1对引物即可鉴别,86份品种用2对引物组合即可鉴别,24份品种用3对引物组合即可鉴别,另外279份品种虽无法单独一一鉴别,但可分为87个小组,组内品种无法区分,组间品种易鉴别。【结论】利用筛选出的21对SSR核心引物,构建了包含500份柑橘品种的DNA指纹图谱库,筛选出部分品种的特异标记,可以鉴别221份柑橘品种和87个品种组合,构建了基于毛细管电泳平台的柑橘SSR分子标记品种鉴定体系。
    食品科学与工程
    采后O3处理对采前CPPU处理猕猴桃果实乙烯代谢的影响
    苏苗,罗安伟,李琳,李圆圆,白俊青,李锐,方沂蒙,宋俊奇,蔺志颖,刘占德
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2980-2989.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.013
    摘要 ( 12 )   HTML ( 1 )   PDF (484KB) ( 36 )   收藏
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    【目的】探究臭氧(ozone,O3)是否能有效减轻膨大剂(N-2-氯-4-吡啶基苯-N’-苯基脲,CPPU)对猕猴桃带来的负面影响,为市场上使用CPPU猕猴桃的贮藏提供信息。【方法】以采前盛花期28d使用20 mg·L-1 CPPU处理和对照用清水蘸果处理的秦美猕猴桃为试验材料,研究不同浓度的O3处理(0、10、40、70 mg·m-3)对贮藏期间猕猴桃果实乙烯代谢过程中的蛋氨酸(methionine,Met)、S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)含量及其相关代谢酶1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACC synthase,ACS)和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase,ACO)活性的影响。【结果】CK组(未使用CPPU也未使用O3处理的为CPPU对照组CK)在贮藏过程中Met、SAM含量以及SAM合成酶、ACS、ACO活性的下降速率均低于CK1组(使用CPPU但未使用O3处理的为臭氧处理对照组CK1);贮藏60 d时,CK1和各O3处理(10、40、70 mg·m-3)的Met含量分别为1.36、2.62、4.41和2.60 mg·(100 g)-1,O3处理显著高于CK1(P<0.05);CK1和40 mg·m-3 O3处理的SAM含量分别为15.48 mg·(100 g)-1和20.73 mg·(100 g)-1,具有显著性差异(P<0.05),而CK1和10 mg·m-3 O3处理组、70 mg·m-3 O3处理组无显著性差异(P>0.05);CK1和各O3处理(10、40、70 mg·m-3)的ACC含量分别为0.068、0.059、0.038和0.055 nmol·g-1,40、70 mg·m-3 O3处理与CK1具有显著性差异(P<0.05);CK1和各O3处理(10、40、70 mg·m-3)的ACS活性分别为0.084、0.069、0.054和0.080 nmol·(g·h)-1;ACO活性的峰值分别为0.062、0.046、0.029和0.051 nmol·(g·h)-1,O3处理和CK1之间存在显著性差异(P<0.05);CK1和各O3处理(10、40、70 mg·m-3)的乙烯的峰值分别为18.42、15.99、9.86、11.69 μL·kg-1·h-1;呼吸高峰分别是18.77、16.15、12.24、15.48 mg·kg-1·h-1。【结论】CPPU增加了猕猴桃乙烯释放量,加速了果实软化,对猕猴桃贮藏带来负面影响,O3处理能有效抑制猕猴桃的乙烯代谢,延缓果实软化,因此O3处理能有效减缓因使用CPPU而导致的猕猴桃后熟软化进程。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    绵羊Y染色体特异性引物及SNPs的筛选
    曹学涛,裴生伟,张晋,李发弟,李刚,李万宏,乐祥鹏
    中国农业科学. 2018, 51(15):  2990-2999.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.014
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    【目的】哺乳动物Y染色体雄性特异区在减数分裂过程中不与X染色体发生重组,遵循严格的父系遗传,是研究父系遗传多样性的重要遗传资源;此外绝大多数Y染色体基因主要或者特异性的在睾丸组织中表达,并在精子发生和雄性繁殖力方面扮演着至关重要的作用。由于Y染色体测序极其困难,造成很多物种Y染色体序列很少。因此本文基于目前现有牛科动物Y染色体引物信息,旨在鉴定绵羊Y染色体特异性引物,比较绵羊Y染色体基因片段与岩羊、牛、山羊和牦牛Y染色体的差异,同时筛选不同绵羊品种在Y染色体基因片段内的SNPs,将找到的Y-SNPs和绵羊的睾丸大小进行相关性分析,为鉴定绵羊Y染色体基因片段奠定基础,并为今后绵羊Y染色体单倍型的构建、绵羊胚胎性别早期鉴定和公绵羊繁殖力相关分子标记的筛选提供科学依据。【方法】根据目前文献公布的29对牛科动物Y染色体特异性引物序列,以母绵羊和水分别作阴性和空白对照,以公绵羊DNA为模板验证引物的雄性特异性;确定绵羊Y染色体特异引物后,利用DNA混合池测序结合限制性长度片段多态性等技术在萨福克羊(n=146)、白萨福克羊(n=91)、东弗里升羊(n=6)、特克塞尔羊(n=72)、南非肉用美利奴羊(n=17)、杜泊羊(n=32)、湖羊(n=55)、藏羊(n=34)、滩羊(n=43)和岩羊(n=14)公羊群体中进行Y-SNPs扫描。用Chromas和DNASTAR等软件分析混合池测序的结果,利用DNAman软件将绵羊Y染色体基因片段与牦牛、山羊、黄牛和岩羊进行同源性分析。同时,测量萨福克羊、白萨福克羊、东弗里升羊、特克塞尔羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊周岁的阴囊围,利用SPSS 19.0软件分析SNPs位点与公羊阴囊围的相关性。【结果】在分析的29对引物中,6对引物为绵羊Y染色体特异性引物,分别能扩增出ZFY3、SRY6、USP9Y、UTY、SRY11和ZFY6片段。17对引物未能出现扩增条带,6对引物在母羊DNA中出现扩增条带。通过比对发现绵羊6个基因片段与岩羊、牛、山羊、牦牛的同源性在81.51%—98.84%。此外,首次在萨福克和白萨福克羊群体的SRY11片段中鉴定得到一个G>A的突变,通过Hpy188I酶切分析发现在萨福克羊、白萨福克羊中有2种基因型(AA、GG),在其他7个绵羊品种中只有GG基因型。在白萨福克羊群体中,GG基因型的频率为0.747,AA基因型的频率为0.253;在萨福克羊群体中GG基因型的频率为0.986,AA基因型的频率为0.014;说明在萨福克羊和白萨福克羊群体中,GG基因型为优势基因型。关联分析显示在白萨福克羊群体中,GG基因型个体周岁的阴囊围显著的高于AA基因型(P=0.029)。【结论】鉴定得到6个绵羊Y染色体基因片段,它们与牛、山羊、牦牛和岩羊具有较高的同源性,表明Y染色体基因在进化过程中具有一定的保守性。首次在萨福克和白萨福克羊群体SRY11片段中找到一个Y-SNP(G>A),其与白萨福克羊周岁的睾丸大小紧密相关。
    转录组测序筛选牛卵泡发育相关基因及其表达差异分析
    李鹏飞,孟金柱,景炅婕,毕锡麟,王锴,朱芷葳,吕丽华
    中国农业科学. 2018, 51(15):  3000-3008.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.015
    摘要 ( 33 )   HTML ( 1 )   PDF (409KB) ( 71 )   收藏
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    【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,qRT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35, PTGRF, ARID4B, GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;qRT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P<0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P<0.01),PTGRF, GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P>0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。
    研究简报
    玉米SRO基因家族的鉴定及表达分析
    赵秋芳,马海洋,贾利强,陈曙,陈宏良
    中国农业科学. 2018, 51(15):  3009-3019.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.016
    摘要 ( 25 )   HTML ( 5 )   PDF (1246KB) ( 51 )   收藏
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    【目的】SRO(similar to rcd one)是植物所特有的一类小蛋白家族,其在植物的生长发育,及应对非生物胁迫中发挥着重要功能。基于玉米全基因组数据库,鉴定玉米SRO家族基因,分析其序列、基因定位、蛋白结构及其系统进化关系,同时解析ZmSROs在玉米组织表达特异性及其在高盐和干旱胁迫下的表达变化,为阐明SRO基因在玉米生长和逆境响应中的功能研究奠定基础。【方法】利用拟南芥SRO家族基因为探针,在玉米全基因组查找并下载玉米SRO基因序列,并从MaizeGDB中获取玉米SRO基因相关信息,包括CDS、氨基酸序列及染色体位置等。通过生物信息学工具(GSDS2.0、Expasy-protparam、SOPMA、Plant-mPLoc、EMBL-EBI、MEME)对获得序列的基因结构、蛋白质分子量、等电点、二级结构、亚细胞定位、保守结构域、保守基序原件等进行预测和分析。同时利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源序列比对并构建系统进化树。运用实时荧光定量PCR技术分析玉米SRO组织表达特异性及其在高盐和干旱胁迫下SRO的表达变化情况。【结果】从玉米全基因组共鉴定6个SRO家族基因,分别命名为ZmSRO1a—ZmSRO1f。ZmSROs分布于第1、4、5和9染色体,包含2—5个内含子。序列分析发现CDS序列长度在1 215—1 791 bp;编码氨基酸数目为404—596 aa;分子量为45.23—66.78 kD;等电点为7.01—9.17。亚细胞定位分析发现ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1c/ZmSRO1d定位于叶绿体,ZmSRO1e则定位于过氧化氢酶体,ZmSRO1f定位于细胞核。系统进化树分析发现ZmSROs分为3个亚类,Ⅰa亚类包括ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1c,Ⅰb亚类包括ZmSRO1f,Ⅰc亚类包括ZmSRO1d/ZmSRO1e。保守结构域分析结果显示ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1c/ZmSRO1d/ZmSRO1e包含PARP和RST结构域,缺少WWE结构域,ZmSRO1f包含WWE和PARP催化中心,RST结构域缺失。ZmSROs蛋白共找到5个保守基序,命名为基序1—5。ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1c包含所有保守基序,ZmSRO1d/ZmSRO1e缺少保守基序3,ZmSRO1f缺少保守基序5。组织表达分析发现ZmSROs在根系特异性表达。高盐胁迫下,玉米根系中ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1c/ZmSRO1d/ZmSRO1e在1 h时显著上调表达,地上部中ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1d/ZmSRO1e均下调表达,而ZmSRO1f在处理6 h显著上调表达。干旱胁迫下,玉米根系ZmSRO1e在1 h显著上调表达,ZmSRO1f在24 h显著上调表达;地上部中ZmSRO1a/ZmSRO1b/ZmSRO1d/ZmSRO1e均下调表达。【结论】玉米SRO家族基因包含6个成员,被划分为3个亚类,6个ZmSROs在玉米根系中特异性表达,且可以不同程度地响应干旱和高盐胁迫。
    新疆南部图兰扇头蜱及卵携带R. raoultii的分子检测
    刘永宏,李贝贝,李凯瑞,何波,张敬博,蒲小峰,陈梅娟,潘姣姣,李飞,张路瑶,赵丽
    中国农业科学. 2018, 51(15):  3020-3028.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.017
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    【目的】世界上蜱类3科18属899种,中国有2科10属117种,新疆至少有2科10属45种,占全国蜱种类的1/3之多,分布也极其广泛。蜱直接危害和传播多种病原,且一些病原可经卵垂直传播,给畜牧业造成巨大经济损失,还严重威胁公共卫生安全。图兰扇头蜱是新疆南部荒漠及半荒漠地区常见种和优势种。确定新疆南部图兰扇头蜱及其卵是否携带立克次体,对该蜱及其传播立克次体病的防控意义重大。【方法】对新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室在新疆南部阿拉尔市某羊场收集的饱血雌性扇头蜱,置于一定湿度和一定温度的环境中产卵,随机取5个独立的卵样品及其对应的5只雌蜱为研究对象。通过对雌蜱及其卵分别处理后提取基因组DNA,进行PCR扩增蜱12S rRNA基因和立克次体16S rRNA基因,并对扩增产物测序,利用BLAST在线平台和多个分子生物学软件进行序列分析。【结果】5只雌蜱12S rRNA基因PCR扩增全部阳性,测序获得的4段蜱12S rRNA基因序列完全一致;Blast分析与GenBank数据库中图兰扇头蜱12S rRNA基因序列相似性高达99%以上,且高相似性前五基因序列均为图兰扇头蜱,其中包括来自新疆绵羊的图兰扇头蜱;本研究蜱12S rRNA基因序列提交GenBank数据库获得登录号为MG744514,与来自于GenBank数据库图兰扇头蜱、血红扇头蜱、微小牛蜱、边缘革蜱、草原革蜱、长角血蜱、小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱、全沟硬蜱及外围群尘螨的22个12S rRNA基因序列的进化树显示,研究所获得的蜱12S rRNA基因序列与图兰扇头蜱进化关系最近,聚在同一个小分支;确定了该扇头蜱为图兰扇头蜱。5只产卵后的雌蜱和相应蜱所产的全部卵立克次体16S rRNA基因PCR扩增,有1只蜱和其产的卵样品阳性,蜱携带率为20%;雌蜱及其卵立克次体16S rRNA基因测序结果完全一致;Blast分析与GenBank数据库中Rickettsia raoultii 16S rRNA基因序列相似性高达99%以上,且高相似性前五基因序列为4个Rickettsia raoultii和1个Rickettsia sp.,其中包括来自新疆2011年的亚洲璃眼蜱和草原革蜱的立克次体;立克次体16S rRNA基因序列提交GenBank数据库获得登录号为MG744513,与来自于GenBank数据库的37个24种立克次体16S rRNA基因序列的进化树显示,研究获得的立克次体16S rRNA基因序列与Rickettsia raoultii进化关系最近,聚在同一个小分支,与其他15种立克次体同属于斑点热群立克次体;确定了本研究图兰扇头蜱及其卵均携带斑点热群立克次体R. raoultii。【结论】首次发现图兰扇头蜱及其卵携带R. raoultii