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当期目录

    2018年 第51卷 第7期 刊出日期:2018-04-01
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    小麦秆锈病新抗源及抗病基因所在染色体特异分子标记
    韩冉,李天亚,宫文萍,李豪圣,宋健民,刘爱峰,曹新有,程敦公,赵振东,刘成,刘建军
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1223-1232.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.001
    摘要 ( 29 )   HTML ( 2 )   PDF (1703KB) ( 267 )   收藏
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    小麦秆锈病是具潜在毁灭性的小麦病害之一,秆锈菌小种Ug99严重威胁全球小麦生产。本研究通过对165份小麦-近缘植物染色体系进行抗秆锈病鉴定,筛选小麦秆锈病新抗源并建立抗病基因所在染色体特异分子标记,以发掘小麦秆锈病新抗源,培育抗病品种,有效防御Ug99导致的秆锈病。【方法】将供试的165份小麦-近缘植物染色体系、3份六倍体小麦及感病对照小密穗分别播种于直径10 cm的瓦盆中,生长到一叶一心时,用中国小麦秆锈菌流行小种34MKGQM和21C3CTHSM进行接种,当感病品种小密穗充分发病时,按照0—4级标准调查记载侵染型,对供试材料的抗秆锈病级别进行统计。同时,提取免疫、近免疫、高抗秆锈病附加系/代换系及其对应的整套染色体系、中国春等材料的基因组DNA,利用101对PLUG引物进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶酶切后进行电泳检测,筛选并建立抗秆锈基因所在染色体特异分子标记。【结果】在165份小麦-近缘植物染色体系中,中国春-卵穗山羊草7Mg#1附加系、中国春-卵穗山羊草7Mg#1(7A)和7Mg#1(7B)代换系、中国春-帝国黑麦1R附加系、中国春-中间偃麦草?Ai附加系(?表示外源染色体同源群未鉴定)、中国春-单芒山羊草6N附加系、中国春-易变山羊草6SvS端体附加系和中国春-智利大麦6Hch附加系9份材料对秆锈病表现为免疫或近免疫;ALCD-尾状山羊草7C#1附加系、中国春-卵穗山羊草7Mg#1(7D)代换系、中国春-帝国黑麦6R附加系、中国春-高大山羊草6Sl#3附加系、中国春-高大山羊草6Sl#2(6B)代换系、中国春-希尔斯山羊草3S#1附加系和中国春-拟斯卑尔脱山羊草2Sg#3附加系7份材料对秆锈病表现为高抗;其余材料均表现为中感或高感。抗秆锈性基因定位信息比较分析发现,高大山羊草6Sl#2和6Sl#3、帝国黑麦6R、智利大麦6Hch、卵穗山羊草7Mg#1、尾状山羊草7C、中间偃麦草?Ai染色体上可能含有抗秆锈新基因。分子标记筛选、定位及特异性验证研究共获得8个新的多态性标记,其中5个(TNAC1715、TNAC1718、TNAC1737、TNAC1739和TNAC1753)和3个(TNAC1740、TNAC1751和TNAC1756)分别被定位在6R6Sl染色体上。【结论】筛选得到8份可能含有抗秆锈新基因的材料,建立了抗秆锈基因所在染色体特异新标记8个。
    玉米籽粒淀粉粒密度基因tw1的精细定位
    孙粲然,张雪海,马指挥,郭战勇,汤继华,付志远
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1233-1243.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.002
    摘要 ( 60 )   HTML ( 9 )   PDF (11973KB) ( 173 )   收藏
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    【目的】淀粉粒密度影响籽粒容重,通过对一个玉米籽粒淀粉粒密度突变体Mrd进行鉴定和精细定位,为容重相关基因的克隆和功能验证奠定基础。【方法】以育种选系过程中发现的一个淀粉粒密度突变体Mrd为材料,利用近红外光谱分析仪检测其籽粒内部化学成分的变化,用扫描电镜观察授粉后18—45 d正常籽粒和突变籽粒中淀粉粒形态的差异;于2014—2016年分别在河南郑州和原阳以及海南三亚种植Mrd与B73的杂交组合及F2和BC1分离群体,并对其进行遗传分析;使用来自maizeGDB(http://www.maizegdb.org)的覆盖全基因组的1 000对SSR引物,通过集团分离分析法(bulked segregation analysis,BSA)筛选与目的基因紧密连锁的标记,实现目的基因的初步定位;并在该定位区间内开发新的标记,对从38 000 BC1分离群体中筛选出的交换单株进行基因型分析,实现目的基因的精细定位;通过候选基因序列分析、功能预测和等位性测验确定首选候选基因。【结果】该突变体籽粒较正常籽粒体积变小,比重增加;细胞学和化学组份分析结果表明,与野生型籽粒相比,突变体籽粒中的粗蛋白含量降低,粗淀粉含量没有显著变化,淀粉粒形状不规则且变小、密度增加,可能是导致籽粒容重变大的原因;对授粉后不同天数籽粒内部淀粉粒结构的观察显示,突变体籽粒淀粉粒的密度比正常籽粒密度大,并随发育进程不断增加;对Mrd与B73的F2及测交后代分离群体的遗传分析结果表明,Mrd籽粒突变是由单隐性基因(命名为tw1)控制的;该基因首先被定位在第6染色体的SSR标记umc1105和bnlg1154之间,物理距离为22 Mb;利用上述2个标记对BC1群体进行交换单株筛选,并开发标记,将该基因定位于SSR标记B3和A47之间,物理距离为0.2 Mb;在该候选区段内有包含su2在内的3个候选基因,等位性测验结果表明,tw1su2不是等位基因;候选基因序列分析和功能预测结果表明GRMZM2G042607编码的蛋白具有碳水化合物识别结构域,在种子中对碳水化合物的储藏起沉积作用,是tw1最可能的候选基因。【结论】实现了籽粒淀粉粒密度突变性状基因tw1的精细定位,并确定了候选基因为编码一种β-1,3半乳糖基转移酶的GRMZM2G042607。
    大豆抗豆卷叶螟的转录组和蛋白质组关联分析
    曾维英,孙祖东,赖振光,蔡昭艳,陈怀珠,杨守臻,唐向民
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1244-1260.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.003
    摘要 ( 33 )   HTML ( 2 )   PDF (4398KB) ( 469 )   收藏
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    【目的】通过对大豆受豆卷叶螟幼虫胁迫下的转录组和蛋白质组结果进行联合分析,筛选出一些与大豆抗豆卷叶螟相关的候选基因,为深入认识大豆抗豆卷叶螟的分子调控机制奠定基础。【方法】以高抗材料赶泰-2-2(HR)和高感材料皖82-178(HS)为研究对象,运用RNA-Seq技术和iTRAQ技术鉴定出豆卷叶螟幼虫取食诱导0和48 h时样品间的差异表达基因(DEGs)和差异表达蛋白(DEPs),将在蛋白水平和转录水平关联到的所有可定量数据进行关联分析,计算蛋白水平和转录水平间的相关系数。【结果】蛋白质鉴定结果表明,HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比较组中分别鉴定出236、250、213、211个DEPs;转录组鉴定结果表明,HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比较组中分别鉴定出1 064、680、605、468个DEGs。定量关联分析结果表明,HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比较组的相关系数r分别为0.156、0.2687、0.1149和0.035;HR48/HR0、HS48/HS0、HR0/HS0和HR48/HS48比较组中分别关联到11、9、3和4个DEPs/DEGs,其中蛋白和mRNA表达趋势相同的基因分别有11、9、2和3个,蛋白和mRNA表达趋势相反的基因分别有0、0、1和1个。生物信息学分析结果表明,这些差异蛋白功能涉及代谢途径、核糖体、类黄酮生物合成、亚油酸代谢、氨基糖-核苷酸代谢、氨酰生物合成、亚麻酸代谢、次生代谢产物的生物合成、苯基丙酸生物合成、RNA运转、谷胱甘肽代谢、抗坏血酸盐和aldarate代谢等。功能关联分析结果表明,HR48/HR0比较组中有27条Pathway通路共关联到101个DEPs和23个DEGs,HS48/HS0比较组中有15条Pathway通路共关联到147个DEPs和16个DEGs,HR0/HS0比较组中有18条Pathway通路共关联到82个DEPs和10个DEGs,HR48/HS48比较组中仅有1条Pathway通路关联到71个DEPs和2个DEGs。同时关联发现胰蛋白酶抑制剂A、K型胰蛋白酶抑制剂、查尔酮异构酶4、脂氧合酶9、α-加氧合酶1、9S-脂氧合酶、植物凝集素前体、POD12、应激蛋白SAM22和cAPX1等可能是大豆抗豆卷叶螟潜在的靶标蛋白(基因)。qRT-PCR表达分析结果表明,5个DEPs/DEGs在HR48/HR0比较组的表达趋势与它们的RNA-Seq和iTRAQ结果基本一致。【结论】确定了一些与豆卷叶螟的抗性相关蛋白(基因)和代谢通路,这些差异蛋白可能直接或间接参与大豆对豆卷叶螟的抗虫反应。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    温度和土壤水分与Bt棉铃壳中杀虫蛋白表达关系及其氮代谢生理机制
    张祥,王剑,彭盛,芮秋治,李丽楠,陈媛,陈源,陈德华
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1261-1271.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.004
    摘要 ( 38 )   HTML ( 2 )   PDF (834KB) ( 56 )   收藏
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    【目的】明确温度和土壤水分对Bt棉杀虫蛋白含量及其氮代谢活性的影响,为生产中Bt棉抗虫性的安全稳定利用提供理论参考。【方法】2016—2017年以转Bt抗虫基因抗虫棉常规品种泗抗1号(SK1)和杂交种泗抗3号(SK3)为材料,采用盆栽法,设置29℃、32℃、35℃、38℃ 4个温度水平,土壤最大持水量的80%、70%、60%、50%、40% 5个土壤水分水平,观察温度和土壤水分对Bt棉铃壳杀虫蛋白含量的影响,各处理持续胁迫4 d。2016年主要研究各处理对Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量的影响;在此基础上,2017年进一步探讨各处理对铃壳中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、蛋白酶、肽酶活性的影响。【结果】SK1和SK3杀虫蛋白含量均在32℃、最大持水量为60%时最高,分别达到471.1 ng·g-1 FW和351.7 ng·g-1 FW。在同一土壤水分条件下,32℃最利于SK1和SK3杀虫蛋白表达;同一温度条件下,最大持水量60%利于SK1和SK3杀虫蛋白表达。对杀虫蛋白含量与温度和土壤水分关系进行二元多项式回归分析发现,Bt棉杀虫蛋白含量(Y)与温度(X2)和土壤水分(X1)呈二元二次方程关系,其中SK1、SK3相关方程分别为Y=-3230.2+17.2X1+199.1X2-0.3X12-3.7X22-0.7X1X2 r=0.829**)、Y=-3322.0+40.7X1+145.2X2-0.3X12-2.0X22-0.3X1X2r=0.739**)。SK1的杀虫蛋白表达量最大的温度和土壤水分条件为31.8℃、57.8%,SK3为33.2℃、60.8%。氮代谢相关生理特征表明,SK1和SK3均表现为在32℃和土壤含水量为60%处理下,棉铃中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)活性较高,蛋白酶、肽酶活性较低;杀虫蛋白含量与可溶性蛋白和GOT活性呈极显著正相关关系(r=0.613**;r=0.735**),与蛋白酶活性和肽酶活性呈极显著负相关关系(r=-0.724**;r=-0.738**)。【结论】温度和土壤水分通过调控蛋白质分解和合成,共同影响Bt棉杀虫蛋白表达,且与其含量呈二元二次方程关系。
    套作对大豆苗期茎秆纤维素合成相关糖类物质转化的影响及其与叶片光合的关系
    任胜茂,邓榆川,文凤君,Sajad Hussain,蒲全明,于晓波,刘卫国,杨文钰
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1272-1282.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.005
    摘要 ( 39 )   HTML ( 2 )   PDF (633KB) ( 76 )   收藏
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    【目的】从纤维素合成相关糖类物质转化的角度,阐明玉米大豆套作模式下,大豆苗期茎秆光形态建成的机理。【方法】在大豆单作和玉米大豆套作两种种植模式下,以强耐荫大豆南豆12和弱耐荫大豆南032-4为试验材料,对叶片光合速率和茎秆总碳、纤维素、可溶性糖、蔗糖、β-1,3-葡聚糖等含量进行测定和分析。【结果】与单作相比,套作大豆由于受到玉米荫蔽,苗期光合速率显著降低,但材料间对套作的反应程度不同,强耐荫大豆南豆12受套作荫蔽的影响程度相对较小,在套作下表现出较强的光合能力;套作显著降低了大豆叶片和茎秆的总碳含量,但南豆12的降低幅度显著低于南032-4。相关分析表明叶片光合速率与叶片和茎秆的总碳含量、茎秆的纤维素含量均呈极显著正相关(r=0.952,0.935,0.825,P<0.01),说明荫蔽通过影响大豆叶片的光合速率,减少了光合产物的积累和向茎秆中的分配,导致大豆植株茎秆纤维素含量降低;强耐荫大豆南豆12在荫蔽下的光合速率较高,光合产物积累较多,适合套作种植。在整个苗期,虽然套作大豆茎秆可溶性糖含量均显著低于单作,但β-1,3-葡聚糖和蔗糖含量在大豆出苗后30—51 d却表现为套作显著高于单作,且在套作模式下,两个大豆糖类物质转化率差异显著;同一种植模式下,强耐荫大豆南豆12茎秆可溶性糖、蔗糖和β-1,3-葡聚糖的含量和转化率均显著或极显著高于南032-4。对纤维素沉积方式分析表明,同一大豆材料,单作模式下茎秆纤维素快速累积时间和累积速率要高于套作;同一种植模式下,强耐荫大豆南豆12纤维素快速累积时间要短于南032-4,但差异较小,而累积速率要高于南032-4,最终导致南豆12的茎秆纤维素含量显著高于南032-4。【结论】套作荫蔽降低了大豆叶片的光合能力,减少了光合产物向茎秆的运输量和茎秆填充物的含量,改变了茎秆纤维素的沉积方式,使得纤维素的含量降低;而强耐荫性大豆南豆12在套作模式下能保持较高光合能力和茎秆纤维素合成能力,具有较强的抗倒伏性。
    水氮互作对冬油菜氮素吸收和土壤硝态氮分布的影响
    谷晓博,李援农,黄鹏,杜娅丹,陈朋朋,方恒
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1283-1293.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.006
    摘要 ( 38 )   HTML ( 3 )   PDF (470KB) ( 116 )   收藏
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    目的】针对西北地区冬油菜蕾薹期干旱频发,农民大量灌溉和施氮导致的环境问题,探究西北地区冬油菜蕾薹期适宜的灌溉量和施氮量。【方法】通过2年田间试验,研究分析蕾薹期不同灌溉量(不灌溉(I0)、灌60 mm(I1)和灌120 mm(I2))和施氮量(不施氮(N0)、施氮80 kg·hm-2N1)和施氮160 kg·hm-2N2))下,地上部干物质量、籽粒产量、氮素吸收与分配、土壤硝态氮分布和氮素利用效率的差异,其中全生育期不施氮(不基施、不追施)和不灌溉为对照处理(CK)。【结果】蕾薹期灌溉或施氮能显著提高冬油菜的地上部干物质量、籽粒产量、产油量和氮素吸收量。土壤硝态氮峰值所在的土层深度随灌水量的增加而明显下移,且峰值随施氮量的增加而明显增加,表现出明显的淋洗趋势。I1N1处理的土壤硝态氮累积量与I0N0处理间不存在显著差异,但与I2N2相比,却显著降低41.9 kg·hm-2I0、I1和I2处理土壤硝态氮主要分布在0—40、40—80和80—160 cm。2个冬油菜生长季,I2N1处理的籽粒产量和产油量均最大,平均为3 385和1 429 kg·hm-2CK最小,平均为1 391和585 kg·hm-2。与I2N1相比,2012—2013年(干旱年)I1N1处理的籽粒产量显著降低,但产油量无显著差异;2013—2014年(平水年)二者的籽粒产量和产油量均不存在显著差异。2年I1N1处理平均籽粒产量和产油量分别为3 264和1 358 kg·hm-2,仅比I2N1降低3.6%和4.7%。I1N1处理的平均氮肥农学利用率比I2N1降低7.2%。【结论】为提高冬油菜籽粒产量和氮素利用效率,减轻土壤硝态氮的下移趋势和下移量,I1N1处理(灌溉60 mm,施氮80 kg·hm-2)为较优的灌溉施氮策略。
    植物保护
    甘薯羽状斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立
    姜珊珊,冯佳,张眉,王升吉,辛志梅,吴斌,辛相启
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1294-1302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.007
    摘要 ( 26 )   HTML ( 1 )   PDF (1930KB) ( 101 )   收藏
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    【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从GenBank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAMP特异性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同时设计2条反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特异性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分别设置F3/B3﹕FIP/BIP引物浓度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),dNTPs浓度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825 mmol·L-1),Betaine浓度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反应温度(59、61、63、65、67和69℃)和反应时间(20、30、40、50、60、70、80和90 min),对RT-LAMP反应体系各条件进行优化,确定最佳反应体系。通过测序及酶切对RT-LAMP产物进行鉴定。以携带SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯叶片的总RNA为模板,分别进行RT-LAMP和RT-PCR特异性检测;带有SPFMV的甘薯总RNA进行10倍梯度稀释,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液为模板进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度测定。最后利用优化的RT-LAMP体系对山东省多地采集的SPFMV疑似病样进行检测,加入SYBR green I进行可视化检测。【结果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特异性检测方法,优化的反应体系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP为0.8 µmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3为0.2 µmol·L-1,dNTPs为0.325 mmol·L-1,Betaine为1 mol·L-1;65℃反应70 min。特异性试验显示本研究建立的RT-LAMP只对携带SPFMV的RNA能够扩增出典型的梯状条带。RT-LAMP最低可检测的RNA浓度为121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能检测的RNA浓度为121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高10倍。田间样品检测,RT-LAMP扩增结果与可视化检测结果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用到SPFMV的田间检测。【结论】建立的RT-LAMP快速检测方法灵敏度高、特异性好,适用于SPFMV的田间快速检测。
    飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1的分子特性及功能分析
    杨亚亭,赵小明,秦忠玉,刘卫敏,马恩波,张建珍
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1303-1314.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.008
    摘要 ( 20 )   HTML ( 2 )   PDF (1578KB) ( 95 )   收藏
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    【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库搜索并克隆获得飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1(nymph cuticle protein 1),分析其序列特征和表达特性,通过蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导和干扰20E受体基因LmEcR表达研究其表达调控,并基于RNA干扰(RNAi)方法分析其生物学功能,为阐明该基因在飞蝗表皮发育过程中的作用提供理论依据。【方法】依据飞蝗转录组数据库获得表皮蛋白基因LmNCP1,结合RT-PCR技术克隆获得其全长开放阅读框(ORF)序列,并结合飞蝗基因组序列分析其基因结构及序列特征;使用MEGA 6.0软件中邻接法(neighbor-joining,NJ),与其他昆虫同源序列聚类分析,并根据聚类结果进行命名;利用reverse-transcription quantitative PCR(RT-qPCR)分析其在5龄飞蝗不同组织和不同发育天数的基因表达特性;通过体内注射20E诱导以及干扰20E受体基因LmEcR的表达,RT-qPCR检测该基因的表达情况;基于RNAi结合H&E染色方法分析其生物学功能。【结果】通过搜索获得表皮蛋白基因LmNCP1,并进行了克隆和测序验证,获得457 bp的cDNA序列,其全长ORF序列为306 bp,编码101个氨基酸。氨基酸序列分析表明该基因编码的蛋白含有1个信号肽,不含几丁质结合域,但包含3个重复基序,Weblogo分析结果显示其在物种间具有保守性。系统进化树分析显示该蛋白与蜚蠊目蟑螂(Blaberus craniifer)BcNCP1序列一致度最高,聚为一支。根据聚类结果将该蛋白命名为LmNCP1(GenBank登录号:MF326211)。RT-qPCR结果显示LmNCP15龄若虫体壁中高表达,在翅芽、前肠和脂肪体中表达次之,在中肠、后肠、胃盲囊和马氏管中表达量较低或不表达;LmNCP15龄早期(N5D1和N5D2)高表达,随后表达量逐渐降低(N5D3—N5D6),到下一次蜕皮前表达有所升高(N5D7),其表达量动态与内表皮形成时间一致。20E诱导不同时间结果显示,与对照组相比,LmNCP1在20E诱导1 h和3 h后表达量显著上调,分别上调了1.3倍和0.9倍;利用RNAi方法干扰LmEcR 48 h和72 h后,与对照组相比,LmNCP1表达量均显著降低,分别降低了71%和87%。利用RNAi方法在4龄和5龄第2天分次注射dsLmNCP1后,飞蝗仍能够正常蜕皮,无致死表型,但对其表皮进行H&E染色发现,与对照组相比,其内表皮形成减少,导致表皮显著变薄,表皮层厚度约减少了33%。【结论】飞蝗表皮蛋白LmNCP1含有3个物种间保守的重复基序,不含几丁质结合域,属于其他家族蛋白;LmNCP1主要在体壁中高表达,而且响应LmEcR介导的20E信号通路调控;RNAi试验表明,LmNCP1在飞蝗蜕皮过程中参与内表皮的沉积。
    赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能
    刘小强,蒋红波,李慧敏,熊英,王进军
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1315-1324.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.009
    摘要 ( 28 )   HTML ( 2 )   PDF (2073KB) ( 85 )   收藏
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    【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据GenBank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因TcOctβR3的cDNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(TcRPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达TcOctβR3,进而利用第二信使cAMP含量测定技术分析TcOctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗TcOctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗TcOctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,TcOctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,TcOctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,TcOctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达TcOctβR3后,cAMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活TcOctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉>酪胺(TA)>章鱼胺>多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射dsRNA能有效抑制TcOctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】TcOctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了TcOctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    电渗析法研究紫色土、黄壤和砖红壤的酸化特征
    程永毅,李忠意,白颖艳,刘莉
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1325-1333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.010
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    【目的】研究紫色土、黄壤和砖红壤在快速酸化过程中的酸化特征。【方法】将3种供试土壤在15 V·cm-1的外加直流电压梯度下进行连续30次,每次8 h的电渗析。并通过测定电渗析前后土壤的酸度指标、盐基离子含量以及在电渗析过程中土壤所释放的盐基离子含量来分析土壤的酸化特征。【结果】电渗析法可在短时间内实现土壤的快速酸化,3种土壤的pH均降低至4.5以下的强酸化水平。电渗析后,3种土壤的交换性酸、交换性H+和交换性Al3+含量显著增加。紫色土、黄壤和砖红壤的交换性酸含量分别从3.35、0.23和0.76 cmol(+)·kg-1增加至18.9、7.0和5.8 cmol(+)·kg-1,可见紫色土的酸化程度最为严重。土壤酸化后,水溶性和交换性K+、Na+、Ca2+和Mg2+含量降低,其中Ca2+、Mg2+的降低幅度较大。酸化导致土壤的交换性盐基总量和盐基饱和度下降,紫色土、黄壤和砖红壤的盐基饱和度从电渗析前的96.8%、82.6%和47.3%降低至电渗析后的20.5%、11.8%和12.2%。尽管紫色土的交换性酸含量远大于黄壤和砖红壤,但交换性盐基离子总量和盐基饱和度也大于黄壤和砖红壤。由于各土壤的交换性Ca2+和Mg2+含量大于交换性K+和Na含量,且相对于K+和Na,Ca2+和Mg2+与带负电的土壤颗粒间具有更强的静电引力,因此在酸化过程中,一价盐基离子K+和Na在3种土壤中均表现为快速释放,而二价盐基离子Ca2+和Mg2+表现出缓慢释放和波动释放的规律。3种供试土壤,随着土壤发育程度增加,土壤的潜在酸化风险下降(紫色土>黄壤>砖红壤),但土壤的盐基饱和度表现出紫色土>黄壤≈砖红壤。可以看出,紫色土的酸化特征表现出这种明显的“双面性”,由于紫色土具有较高的CEC值,导致土壤酸化后的交换性酸含量显著高于黄壤和砖红壤,使酸化紫色土上生长的植物存在较高的铝毒害风险;同时,由于紫色土丰富的矿物组分能够对盐基离子进行及时补充,紫色土酸化后仍含有相对较高的盐基离子含量和盐基饱和度,保证了植物生长对盐基养分离子需求,也能在一定程度上缓解紫色土的进一步酸化。【结论】电渗析法可用于模拟土壤的快速酸化过程;土壤的表面负电荷量和复盐基离子能力是决定土壤酸化特征的关键因素;紫色土具有异于地带性土壤黄壤和砖红壤的“双面性”酸化特征。
    测墒补灌和施氮对冬小麦产量及水分、氮素利用效率的影响
    金修宽,马茂亭,赵同科,安志装,姜玲玲
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1334-1344.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.011
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    【目的】测墒补灌是近年来研究的一种小麦节水灌溉新技术。论文旨在探索测墒补灌与施氮对冬小麦生长的影响,为该区节水、节氮提供依据。【方法】采用漫灌的方式设置测墒补灌和施氮两因素田间试验,补灌设置4个处理,于冬小麦拔节期、开花期依据0—40 cm土层土壤质量含水量进行测墒补灌,补灌至土壤田间持水量的50%W1)、60%W2)、70%W3)、80%W4)。施氮设置4个处理,不施氮(N0、施纯氮180 kg·hm-2N180、240 kg·hm-2N240和300 kg·hm-2N300)。在此处理下研究了测墒补灌和施氮对冬小麦产量及水分、氮素利用效率的影响。【结果】(1)各施氮处理下,补灌量的增加可增加冬小麦籽粒产量,当补灌量至土壤田间持水量的60%—80%范围内时,冬小麦籽粒的增产效应差异不显著。各补灌处理下,当施氮量超过240 kg·hm-2时籽粒产量无显著性变化。本试验条件下当补灌至土壤田间持水量的60%,施氮量为240 kg·hm-2时冬小麦籽粒产量达到最高,为8 104.6 kg·hm-2(2)增加施氮量和补灌量均可显著增加麦田总耗水量,但当施氮量超过240 kg·hm-2时,施氮的提高效果不显著。补灌量的增加会显著增加麦田总耗水量,但当补灌至土壤田间持水量60%(W2)、70%(W3)时较补灌至80%(W4)处理显著降低耗水量,说明有利于节约灌水而获得较高产量。(3)相同施氮处理下,补灌量的增加可显著提高冬小麦水分利用效率,当补灌量增至土壤田间持水量的60%时,冬小麦水分利用效率达到最大值,为14.7 kg·hm-2·mm-1。相同补灌处理下,增施氮肥可显著提高冬小麦水分利用效率但施氮量不宜超过240 kg·hm-2,否则将导致水分利用效率降低。(4)相同施氮处理下,应控制补灌量至土壤田间持水量的60%时冬小麦氮素干物质生产效率及氮素利用效率最高,为60.1 kg·kg-122.4 kg·kg-1。相同补灌处理下,施氮量应控制在240 kg·hm-2时可获得较高的氮素干物质利用效率及冬小麦氮素利用效率最高,为63.9 kg·kg-123.5 kg·kg-1。【结论】本试验条件下当施氮量为240 kg·hm-2、冬小麦拔节期、开花期补灌至土壤田间持水量的60%时冬小麦籽粒产量、水分利用效率、氮素干物质利用效率、氮素利用效率均最高,为最优的节水、节氮、高产组合,推荐其作为该区域适宜水、氮用量。
    园艺
    苹果生长素响应因子MdARF5的克隆与功能鉴定
    安建平,宋来庆,赵玲玲,由春香,王小非,郝玉金
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1345-1352.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.012
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    【目的】分离苹果生长素响应因子MdARF5(Auxin Response Factor 5),分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示MdARF5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica ‘Royal Gala’)为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个ARF(Auxin Response Factor)转录因子,并将其命名为MdARF5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析MdARF5对MdMYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子MdARF5(序列号:MDP0000143749),该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果MdARF5与梨PbARF5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达MdARF5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明MdARF5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个MdARF5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,MdARF5能够抑制MdMYB1的表达。【结论】推测苹果MdARF5可能通过直接抑制MdMYB1的表达负调节花青苷的积累。
    过量表达RdreB1BI对草莓果实品质及相关基因的影响
    阎依超,万春雁,古咸彬,郭成宝,陈月红,高志红
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1353-1367.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.013
    摘要 ( 24 )   HTML ( 1 )   PDF (489KB) ( 95 )   收藏
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    【目的】研究外源基因RdreB1BI转入对‘红颊’草莓果实品质及相关基因表达的影响,揭示RdreB1BI在草莓果实品质调控中的作用及分子机理。【方法】以5个转RdreB1BI株系及非转基因‘红颊’草莓全红期果实为材料,测定果实纵横径、单果重、可溶性糖、可溶性蛋白、抗坏血酸等风味物质及花青苷、总黄酮、总酚等着色物质的含量。应用BLASTn、GENEFINDER和PlantCARE等生物信息学方法分析外源基因和7个次生代谢产物合成途径相关基因(RdreB1BIFractinFvC4HFvCCR2FvGSTFvF3HFvDFRFvMYB306)的结构,并预测基因启动子作用元件。采用qRT-PCR定量法检测相关基因表达量,应用7300 system软件和2-△△Ct法分析数据。对生理生化及分子数据进行方差及相关性分析,综合讨论RdreB1BI的转入对‘红颊’草莓果实品质及相关基因表达的影响。【结果】转基因‘红颊’草莓株系与野生型果实单果重的范围为11.75—15.42 g,纵径和横径的范围分别为35.12—40.42 mm及28.73—32.6 mm,仅株系8果实纵径显著大于株系7,其余指标间差异不显著。其中转基因株系1和7的花青苷含量显著高于野生型;转基因株系1、7及8总黄酮含量显著高于野生型;各转基因株系的总酚含量均显著高于野生型。转基因株系1、7和8果实的可溶性糖含量显著高于野生型(21.70 mg·g-1 FW),分别为野生型的2.87、3.39和3.35倍。可溶性固形物含量与可溶性糖含量呈正相关(r=0.811*),但样品果实的可溶性固形物含量间不存在显著性差异。转基因株系草莓成熟果实果肉中氨基酸含量为0.2580—0.3950 g/100 g FW,野生型果实的氨基酸含量为0.5151 g/100 g FW,显著高于各转基因株系草莓果实;转基因株系1和7的可滴定酸含量显著高于野生型;转基因株系1果实的抗坏血酸含量为168.35 mg/100 g FW,显著高于野生型(92.50 mg/100 g FW)。转基因株系9及10果实的可溶性蛋白含量分别为25.97和25.86 mg·g-1 FW,显著高于野生型(22.93 mg·g-1 FW)。RdreB1BIFvCCR2cinnamoyl-CoA reductase 2-like)和FvMYB306(myb-related protein 306)在各转基因株系中表达量显著高于野生型。分析发现差异表达基因启动子区域包含多种高等植物顺势调控元件,主要有对真核生物起增强基因转录效率的CAAT-box和核心启动子元件TATA-box。同时还包含G-Box、G-box、MBS、ARE、5UTR Py-rich stretch等能影响各基因对光的响应、在苯丙烷代谢途径中起调节作用的顺式作用元件。【结论】RdreB1BI调控相关基因参与转化体果实发育和成熟,提高光的有效性,活化黄酮类生物合成通路关键基因,差异基因中均包含大量光诱导响应元件,FvCCR2FvMYB306的表达促进了总黄酮、酚类物质及花青苷等次生代谢物的合成。转入RdreB1BI使草莓果实的多项营养成分和着色物质含量显著增加,改善了草莓的果实品质。
    食品科学与工程
    超高压杀菌处理冷破碎猕猴桃果浆的条件优化及其贮藏期杀菌效果
    杨天歌,邓红,李涵,孟永宏,雷佳蕾,马婧,郭玉蓉
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1368-1377.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.014
    摘要 ( 24 )   HTML ( 2 )   PDF (1217KB) ( 106 )   收藏
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    【目的】研究‘海沃德’猕猴桃冷破碎果浆的超高压杀菌最优条件及超高压处理后果浆贮藏过程中的杀菌效果,为猕猴桃的非热加工及产品开发提供参考。【方法】采用冷破碎技术设备获得猕猴桃纯果肉果浆,以菌落总数、VC、褐变度等为评价指标,利用响应面分析建立模型,得到超高压杀菌最优工艺条件;利用微生物学方法,研究超高压处理的果浆在4℃、-20℃下贮藏期菌落总数、霉菌酵母和大肠杆菌的变化。【结果】通过单因素试验和Box-Behnken模型响应曲面分析获得超高压杀菌的最佳条件为压力497 MPa,温度27℃,保压时间24 min;在此条件下超高压处理对果浆的菌落总数、大肠杆菌、霉菌酵母杀菌率分别达到73.18%、97.46%、100.00%。超高压杀菌的冷破碎果浆于4℃、-20℃下贮藏6周、14周,在符合标准范围内菌落总数的增量较大,与贮藏第1天相比分别达到97.19%、85.98%,但菌落总数增长速度不大;而果浆中的霉菌酵母、大肠杆菌的增量相对较少,且增殖也较慢;果浆中的霉菌酵母、大肠杆菌仅分别为1.36、0.67和0.32、0.35 lg(CFU/mL)。【结论】超高压处理作为一种非热杀菌方式对热敏性的猕猴桃果浆有较好的杀菌效果。冷破碎果浆作为猕猴桃加工的中间原料在超高压处理后于-20℃下贮藏14周依然符合商业无菌要求,因此低温贮藏与超高压杀菌结合有利于冷破碎果浆的贮藏和进一步加工利用。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析
    杨强,徐盼,蒋凯,乔传民,任军,黄路生,幸宇云
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1378-1389.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.015
    摘要 ( 13 )   HTML ( 1 )   PDF (3827KB) ( 142 )   收藏
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    【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor, type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts, PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sgRNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sgRNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lentiCRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒psPAX2和pCMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45 μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6 μg·mL-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5 μg·mL-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、CylinD2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P < 0.01)。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P < 0.01);打靶细胞中,随着传代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力极显著下降(P < 0.01),而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异(P > 0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。
    用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制
    王丹丹,唐雨婷,马月辉,王立刚,潘登科,蒋琳
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1390-1400.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.016
    摘要 ( 25 )   HTML ( 3 )   PDF (1450KB) ( 143 )   收藏
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    【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨 ZBED6 在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析,比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Sus_scrofa10.2为参考序列,用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因,对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪(P<0.05),与ZBED6-WT猪相比,ZBED6-KO猪肌纤维的宽度较宽,结缔组织较少,ZBED6基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用;测序结果显示,各样本获得至少10 G的数据量,每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上,表明测序饱和度良好,测序数据真实可靠;对测序数据进行分析,筛选到 184个差异基因,其中上调的基因114个,下调的基因70个,注释的141个,未注释的43个;差异基因层次聚类分析显示,ZBED6-KO组(x1、x3、x6)的3个个体表达模式相似,ZBED6-WT组(x2、x4、x5)的3个个体表达模式相似;GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目,33条显著的pathway通路,差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和RhoA信号等相关的通路;qRT-PCR 检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】首次以ZBED6-KO巴马小型猪为模型,利用RNA-Seq技术探究了ZBED6敲除对心脏发育和功能的影响,丰富了ZBED6 对心脏发育和功能的研究。
    家蚕glial cell missing (BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能
    张奎,潘光照,苏晶晶,谈娟,徐曼,李钰添,崔红娟
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1401-1411.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.017
    摘要 ( 31 )   HTML ( 2 )   PDF (3380KB) ( 95 )   收藏
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    【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing (BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得BmGcm全长cDNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx 和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和qRT-PCR方法检测BmGcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建BmGcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】BmGcm(BGIBMGA006182)定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长 4 046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其cDNA全长1 734 bp,包含166 bp的5′ UTR、227 bp的3′ UTR和1 341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 kD,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中BmGcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示BmGcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,BmGcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将BmGcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达BmGcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达BmGcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现BmGcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。
    农业经济及管理
    基于产业要素年代差距分析的农业现代化水平国际比较研究
    胡志全,朱殿霄,辛岭,侯丽薇,王东阳
    中国农业科学. 2018, 51(7):  1412-1420.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.07.018
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    【目的】农业现代化是中国“四化同步”的重要组成,分析中国与发达国家农业现代化发展的相对差距,界定中国农业发展的全球定位。【方法】FAO在相关研究中提出:农业现代化发展是一个渐进的规律性过程,该过程伴随着一系列基本特征的趋势性变化。承认农业现代化发展内在的规律性是进行农业现代化水平国际比较的前提条件。在此基础上,论文提出如下两个核心假设作为使用年代差距进行农业现代化发展水平国际比较探究的基础:①不同国家农业现代化发展具有共性特征,不同国家的农业现代化发展会经历相同的历史阶段,在不同阶段表现出大致相同的特征。②核心指标在农业现代化某阶段的单位变化率相同,即不同国家的相关指标在相同发展阶段面临相同的变化率。据此提出计算不同指标序列年代差距的核心计算公式:Dj=Ya-Wjb±(Xa-Xjb)/Xjb。论文在充分借鉴国内外学者相关研究的基础上,建立了包含农业经济效益、经济结构转型、农村经济社会发展、农业可持续发展4个一级指标和10个二级指标组成的综合评价体系。选定美国、英国、日本、印度、巴西、南非六国作为国际比较的典型国家。其中美、英、日三国农业现代化起步早,在农业现代化发展过程中表现出的历史特征,可以作为中国农业现代化发展的长期对照,中国、印度、巴西、南非同为高速变革的发展中国家,面临众多相同的机遇和挑战,宏微观政策各有得失,经验教训更为深刻,将巴西、印度、南非作为典型国家作对比具有参照意义。【结果】测算表明,中国农业现代化发展总体水平大体相当于美、英等国20世纪60年代末到80年代初水平,同日本20世纪90年代初期水平相当,与印度、巴西等国基本处于相同的发展阶段。从分项指标看,中国的农业现代化存在自身发展不均衡问题,各核心指标分化较为严重,耦合性不高,这种不均衡限制了农业现代化总体水平进一步提高。【结论】基于年代差距法的农业现代化水平国际比较方法具有操作简单,易理解,结果直观的特点,可作为分析农业现代化问题,评估农业现代化发展水平的有效工具。