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当期目录

    2017年 第50卷 第7期 刊出日期:2017-04-01
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    玉米主要植株性状的杂种优势位点分析
    刘晓阳,卫晓轶,陈浩,刘坤,谢惠玲,郭战勇,付志远,李卫华
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1179-1188.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.001
    摘要 ( 283 )   HTML ( 2 )   PDF (371KB) ( 386 )   收藏
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    【目的】鉴定玉米株高等植株性状的杂种优势位点为优良玉米新品种选育提供重要的理论依据。【方法】利用一套以综3为供体,许178为受体的单片段代换系群体及其与轮回亲本许178的测交群体,于2014年在河南浚县、新乡、长葛3个试点进行田间鉴定,完全随机区组设计,3次重复,散粉后对株高、穗位高、叶片数进行测定。利用Duncan’s多重比较和t测验分别对玉米株高、穗位高和叶片数进行QTL分析和杂种优势位点分析。【结果】单片段代换系的测交群体在主要植株性状上均表现出一定的杂种优势,其中,株高在浚县、新乡和许昌点的中亲优势值分别为4.74%、3.61%和1.09%,穗位高的中亲优势值分别为6.06%、7.77%和7.51%,叶片数的中亲优势相对较小。利用SSSL群体在3个环境中定位了9个株高的QTL、10个穗位高的QTL、5个叶片数的QTL。利用测交群体定位了6个株高的杂种优势位点,其中3个HL同时被检测到;穗位高检测到8个杂种优势位点,有1个HL被同时检测到;叶片数定位了5个杂种优势位点,有1个HL被同时检测到。利用SSSL及其测交群体分别检测到3个植株性状的24个QTL和19个HL,在5个单片段代换系同时检测到同一性状的QTL和HL。【结论】株高、穗位高和叶片数的杂种优势在单片段代换系测交群体中呈:株高>穗位高>叶片数。定位到的QTL和HL中的一些在不同环境间存在保守性,且具有较大贡献率,这些主效QTL/HL所在的染色体区域可能存在调控所对应性状的主要基因,可作为进一步研究的依据。而且,少数染色体片段同时调控多个性状的杂种优势,表明所测性状间存在相关性。此外,定位到的株高、穗位高多数HL表现出超显性效应,而多数总叶片数相关的HL显示出显性效应,表明所测性状杂种优势主要来源于位点间的超显性效应。所测的3个性状间存在相关性,3个性状间平衡是遗传改良的重要目标。在育种实践中,上述主效QTL和HL可通过分子标记辅助选择,应用于理想株型育种,加快3个性状间协同改良进程。
    油菜耐盐相关性状的全基因组关联分析及其候选基因预测
    贺亚军,吴道明,游婧璨,钱伟
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1189-1201.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.002
    摘要 ( 312 )   HTML ( 2 )   PDF (1163KB) ( 597 )   收藏
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    【目的】通过对甘蓝型油菜耐盐相关性状进行全基因组关联分析,寻找可能与油菜耐盐性相关的SNP位点,发掘与油菜耐盐性有关的候选基因。【方法】以1.2%NaCl溶液作为培养液,去离子水为对照,对307个不同品系的甘蓝型油菜进行发芽试验。播种后7 d测定幼苗根长、鲜重及发芽率,计算盐胁迫下各性状相对值,并作为评价耐盐的指标。结合油菜60K SNP芯片,利用SPAGeDi v1.4软件对该群体307份甘蓝型油菜进行亲缘关系分析,并计算亲缘关系值的矩阵。利用软件STRUCTURE v2.3.4对关联群体进行了群体结构分析。为有效排除假关联的影响,将群体结构和材料间的亲缘关系考虑进关联分析中,同时进行了PCA+K模型、Q+K模型以及K模型3种混合线性模型分析和比较,根据所有SNP的–lg(P)观察值和期望值,确定每个性状GWAS分析的最优模型。采用TASSEL 5.0软件,在最优模型下对307份材料耐盐各性状的相对值分别与SNP标记进行全基因组关联分析。利用油菜基因组数据库,在显著SNP位点侧翼序列200 kb范围内提取基因。根据拟南芥中已经明确功能的耐盐相关基因,筛选出目标基因组区段内与耐盐相关的油菜同源基因。【结果】全基因组关联分析共检测到164个与根长显著关联的SNP位点,23个与鲜重显著关联的SNP位点,38个与发芽率显著关联的SNP位点。其中与根长、鲜重、发芽率最显著关联的SNP位点分别位于染色体A08、A02和A06,贡献率分别为23.84%、18.59%和31.81%。在这些显著SNP位点侧翼序列200 kb范围内发掘出可能与油菜耐盐性有关的50个候选基因。这些候选基因主要包括转录因子MYB、WRKY、ABI1、bZIP、ERF1、CZF1、XERICO等以及一些下游受转录因子调控的不同功能基因NHX1、PTR3、CAT1、HKT、CAX1、ACER、STH、STO等。在根长和发芽率2个不同耐盐性状的分析结果中均筛选出位于A03染色体上的耐盐基因BnaA03g14410D。另外,这些耐盐候选基因中包含两组串联重复基因,分别是位于A03染色体上的BnaA03g18900D和BnaA03g18910D,位于C09染色体上的BnaC09g19080D、BnaC09g19090D和BnaC09g19100D。除此之外,耐盐候选基因中还包含2个距离非常近(中间只间隔2个基因)的重复基因BnaC02g39600D和BnaC02g39630D。【结论】共检测到225个与耐盐性状显著关联的SNP位点,筛选出50个可能与油菜耐盐性有关的候选基因。
    不同抗倒伏能力甜荞品种茎秆木质素及其单体合成特征
    佘恒志,聂姣,李英双,刘星贝,胡丹,马珊,次仁卓嘎,汪灿,吴东倩,阮仁武,易泽林
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1202-1209.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.003
    摘要 ( 137 )   HTML ( 1 )   PDF (957KB) ( 293 )   收藏
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    【目的】研究不同抗倒伏能力甜荞品种在不同生育时期茎秆木质素、总木质素单体及G型、S型和H型木质素单体含量的变化,探讨甜荞茎秆木质素及其单体合成特征。【方法】选用酉荞2号(高抗倒伏、YQ2)、信农1号(中抗倒伏、XN1)和乌克兰大粒荞(易倒伏、UD)为试验材料,试验采用随机区组设计,3次重复。分别于分枝期、盛花期和乳熟期测定其茎秆抗折力、倒伏指数、木质素含量(溴乙酰法)、总木质素单体及S型、G型和H型木质素单体含量(GC-MS法)。【结果】相同生育时期,与XN1和UD相比,YQ2茎秆抗折力大、倒伏指数小;分枝期到乳熟期,茎秆抗折力先增大后减小,在盛花期达到最大值;倒伏指数的变化存在品种差异,分枝期到乳熟期,YQ2和UD倒伏指数先增大后减小,盛花期达到最大值,XN1倒伏指数逐渐增加,乳熟期达到最大值。茎秆木质素和木质素单体含量从分枝期到乳熟期逐渐增加,YQ2木质素和木质素单体含量高于XN1和UD;在相同生育时期,S型木质素单体含量均最高,G型木质素单体次之,H型木质素单体含量均最低;分枝期到乳熟期,S和G型木质素单体含量逐渐增加,H型木质素单体逐渐降低。随着生育时期,S/G(S型木质素单体含量/G型木质素单体含量)的比率逐渐降低,G型木质素单体占总木质素单体的比例逐渐升高。【结论】甜荞茎秆木质素单体主要为S-G型。高抗倒伏品种木质素及其单体的合成特征表现为:各生育时期木质素、总木质素单体、G型、S型和H型木质素单体含量高于中抗倒伏和易倒伏品种;分枝期大量积累S型木质素单体,分枝期到乳熟期主要积累G型木质素单体。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    耕地集约化评价指标体系与评价方法研究进展
    石淑芹,曹玉青,吴文斌,杨鹏,蔡为民,陈佑启
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1210-1222.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.004
    摘要 ( 146 )   HTML ( 1 )   PDF (584KB) ( 404 )   收藏
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    耕地集约化是社会经济发展、土地面积约束、人口增长与技术进步等压力作用下人类土地利用的必然选择。作者在论文中从耕地集约化、农业可持续利用、生态保护及粮食安全的互动框架切入,对现有耕地集约化评价指标体系进行了系统梳理,构建了基于互动框架的耕地集约化评价指标体系,并对现有技术、方法及相关成果分别评述,提出了下一步的研究要点及发展方向。研究认为耕地集约化、农业可持续、生态环境及粮食安全之间主要存在正负双重及互相促进作用。目前评价指标体系主要从频度、投入、产出、潜力、增产、综合指标体系、集约度及能值等多个方面考虑。基于互动框架的耕地集约化评价指标体系包括地均劳动力投入、地均化肥、农药投入及灌溉指数等基本指标,粮食安全系数、非农指数和人均耕地面积等表征农业可持续的指标,地下水矿化度、生物多样性和碳排放等影响生态保护的指标,以及复种指数、稳产指数、粮食单产和地均产值等与粮食安全密切的指标;具体评价时还需依据不同研究区、研究尺度进行针对性选择和修订。研究方法中,频度指标是遥感技术在耕地集约化领域的重点关注热点之一;潜力指标以模型模拟为主;增产指标中,产量差研究成果丰富,收获面积差所受关注较少;集约度综合测度模型也是较为常用的方法。此外,还可引入其他相关成果开展评价。今后耕地集约化指标类型呈多样化态势,需推动新方法与新技术手段的综合集成。
    不同铵硝配比条件下BPDS-Fe(Ⅱ)对玉米幼苗耐低铁胁迫差异的影响
    徐健钦,陈旭蕾,于福同
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1223-1233.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.005
    摘要 ( 105 )   HTML ( 1 )   PDF (1474KB) ( 232 )   收藏
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    【目的】作物生产中缺铁问题十分普遍,筛选耐低铁品种具有重要意义。文中采用BPDS(4,7-diphenyl- l,10-phenanthroline disulfonic acid)专性螯合Fe(Ⅱ),探究BPDS-Fe(Ⅱ)对2种玉米自交系表型特征与生理特性的影响,旨在解析2个自交系耐低铁胁迫差异及其可能机制,为筛选耐低铁品种提供理论依据。【方法】选用2个玉米自交系Wu312与Ye478,以铵硝比1﹕1与1﹕7为供氮条件,分别设置14与10个不同的BPDS-Fe(Ⅱ)浓度,观察植株表型特征,测定叶片SPAD值、地上部与根系干物重、根冠比,测定地上部铁、锰、铜、锌浓度以及新叶活性铁浓度。利用SPAD-502 plus叶绿素仪测定新叶SPAD值;将烘干样品剪碎后,用HNO3-H2O2溶液消煮,经密闭微波消煮后,用ICP-AES测定消煮液中的微量元素;取新叶尖端剪碎,称2.00 g鲜样,按照1﹕10比例加入1 mol·L-1盐酸,震荡5 h后过滤,用ICP-AES进行测定。【结果】在铵硝比1﹕1的供氮条件下,根系产生根系分泌物,根际pH在24 h内从6.0显著下降至约4.0;与对照处理(不供铁)相比,当BPDS-Fe(Ⅱ)浓度为40 μmol·L-1时,Wu312的地上部干物重显著下降了31%,Ye478则显著下降了64%;Wu312根系干物重无显著变化,但Ye478显著下降了63%;二者的根冠比均已超出正常范围(正常值:0.20—0.28),地上部与根系生长受到抑制。调整铵硝比为1﹕7后,当BPDS-Fe(Ⅱ)浓度为40 μmol·L-1时,Wu312地上部干物重是对照幼苗的8倍,Ye478则接近10倍,植株生长恢复正常;Ye478的叶片SPAD值、地上部与根系干物重、新叶活性铁浓度均显著高于Wu312,表现出生长与保绿性方面的显著优势;当BPDS-Fe(Ⅱ)浓度为0.1 μmol·L-1时,Wu312被竞争致死,无法发育出第五片叶,Ye478仍能维持生长,发育至第五片叶,叶片返绿明显;地上部铁浓度在不同自交系间无显著差异;植株地上部铁含量与锰、铜、锌浓度呈显著负相关。【结论】降低NH4+-N的供应比例有利于改善根际pH,减少根系分泌物;Ye478为耐低铁品系,Wu312为铁敏感品系;Ye478与Wu312在0.1 μmol·L-1浓度条件下表型出现最显著差异;地上部与根系生物量、叶片SPAD值是表征玉米幼苗耐低铁胁迫差异的最佳指标,根冠比以及新叶活性铁浓度是良好指标;玉米幼苗耐低铁胁迫的可能机制包括根系分泌质子,地上部将光合作用产物优先分配给根系,以及铁在植物体内的转运与再分配。
    植物保护
    玉米大斑病菌分生孢子形成的影响因素及GATA 转录因子家族的表达分析
    冯胜泽,刘星晨,王海祥,赵洁,赵立卿,郑亚男,巩校东,韩建民,谷守芹,董金皋
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1234-1241.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.006
    摘要 ( 126 )   HTML ( 1 )   PDF (433KB) ( 262 )   收藏
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    【目的】玉米大斑病(northern leaf blight of corn)是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的一种威胁玉米生产的重要叶部病害。本研究旨在确定影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素;明确GATA家族成员基因在分生孢子形成时期的表达特征,为深入解析调控病菌发育及致病的分子机制打下基础。【方法】以玉米大斑病菌野生型菌株01-23为试材,探索13种不同培养基(乳糖酪蛋白琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆琼脂培养基、玉米叶片葡萄糖琼脂培养基、玉米叶片琼脂培养基、玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基、玉米籽粒琼脂培养基、玉米粉葡萄糖琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基、查氏培养基、基本培养基、水琼脂培养基)、5种碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖)、以乳糖酪蛋白琼脂培养基为基础培养基,以5 g·L-1的量分别添加不同的氮源(牛肉膏、蛋白胨、NH4Cl、KNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3)、pH(4、5、6、7、8、9)、温度(15、20、25、30、35℃)及光照强度(1 500、3 000、6 000、9 000 lx)等条件对分生孢子产量的影响;进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,分析病菌菌丝形成时期和分生孢子形成时期GATA家族5个成员基因的表达量。【结果】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素,发现产孢量最大的培养条件为玉米叶片葡萄糖琼脂培养基,碳源为乳糖,培养温度为25℃,pH 8,光照条件为光暗交替各12 h,光照强度为6 000 lx。另外,还发现在培养基中添加KNO3可显著提高分生孢子产量。对GATA家族5个基因的相对表达水平分析表明,与菌丝时期相比,在分生孢子形成时期GATA2的表达量明显上调,其他基因(GATA1GATA3GATA4GATA5)表达量均显著下调。【结论】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的最佳培养条件;根据GATA家族5个基因相对表达分析结果,推测GATA2可能参与了玉米大斑病菌的分生孢子形成。
    番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能
    彭浩然,潘琪,魏周玲,蒲运丹,张永至,吴根土,青玲,孙现超
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1242-1251.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.007
    摘要 ( 146 )   HTML ( 1 )   PDF (2479KB) ( 392 )   收藏
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    【目的】克隆番茄抗性相关基因SlHin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sal I和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-mGFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco I和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv. Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因SlHin1,将序列分别提交至GenBank,得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 kD,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组10号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4 d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光。随着接种时间推移,接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 kD处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达。【结论】Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    东北黑土区旱田改稻田后土壤有机碳、全氮的变化特征
    贾树海,张佳楠,张玉玲,党秀丽,范庆锋,王展,虞娜,邹洪涛,张玉龙
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1252-1262.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.008
    摘要 ( 169 )   HTML ( 1 )   PDF (397KB) ( 360 )   收藏
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    【目的】分析东北黑土区旱田改稻田后土壤有机碳、全氮含量及其密度和13C、15N自然丰度值的动态变化,探讨旱田改稻田后土壤有机碳(氮)的固定能力及其稳定性,揭示旱田改稻田后土壤有机碳(氮)的演变规律,为东北黑土的合理利用和培肥提供理论依据。【方法】结合野外实地调查,选择典型黑土区旱田土壤(种植大豆年限大于60年)和改种不同年限的稻田土壤(3、5、10、17、20和25年,旱田改稻田前种植历史基本相同,均为大豆),利用稳定同位素分析技术,研究旱田改稻田后土壤有机碳、全氮的动态变化特征。【结果】旱田改稻田25年间,在0—60 cm土层,土壤有机碳和全氮含量的变化趋势均表现为:在改种的前3年迅速下降,降幅分别为13.60%—43.27%和10.40%—40.60%,在3—25年间随改种年限延长呈逐渐增加的趋势,且在20—60 cm土层出现累积,但在3—5年期间增加幅度较大,在5—25年期间增加较为缓慢,在改种17—25年期间,稻田土壤有机碳和全氮含量均高于旱田土壤;0—60 cm土层土壤有机碳和全氮密度的变化趋势与其含量的变化趋势大致相同,在改种的3年间0—60 cm土层土壤有机碳和全氮密度分别降低了26.53%和21.89%,在改种5—25年间0—60 cm土层稻田土壤有机碳和全氮密度均大于旱田土壤,增幅分别为9.87%—21.48%和10.2%—19.3%;旱田改稻田后,土壤全氮与有机碳的变化密切相关,土壤全氮与有机碳的含量、密度之间均呈显著线性正相关关系(P<0.01)。在0—60 cm土层,土壤δ13C值在改种的3年间明显上升,在3—25年间随改种年限延长呈逐渐下降趋势,且大于5年的稻田土壤δ13C值均低于旱田土壤,而土壤δ15N值在改种的25年间随改种年限延长呈逐年下降趋势,各年限稻田土壤δ15N值均低于旱田土壤,相同年限土壤的δ13C值和δ15N值均随着土层加深而增大;0—40 cm土层土壤δ13C值与土壤有机碳含量之间呈显著线性负相关关系(P<0.01),但各土层土壤δ15N值与土壤全氮含量之间则无显著相关性。【结论】东北黑土区旱田改稻田大于5年后,稻田土壤具有明显的固碳(氮)能力,稳定性碳(氮)在20—60 cm土层累积;改种稻田年限小于5年,应注重有机碳(氮)的补充,以维持和提高土壤有机碳(氮)水平。
    基于根微形态测定土壤Zn对大麦的毒性阈值及其预测模型
    何俊,田昕竹,王学东,刘彬,李宁,郑涵,孟楠,陈世宝
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1263-1270.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.009
    摘要 ( 74 )   HTML ( 1 )   PDF (488KB) ( 180 )   收藏
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    目的】随着对污染土壤管理要求的不断提高,受污染土壤生态风险评价的内容也在不断深入。目前,污染土壤风险评价毒性测试逐渐由单物种测试为基础的生态风险评价发展为基于物种敏感性分布的区域种群毒性测试;毒性中除了要包含测试物种的整个生命周期,还需要增加不同敏感的测试终点。基于不同测试终点的毒理学数据对于评价污染土壤中Zn的环境风险具有重要意义。根系生态是基于生态效应法推导土壤中重金属生态风险阈值的重要组成部分,论文中以大麦根尖数、总根长、根表面积和根平均直径为评价终点,研究污染土壤中Zn对大麦根微形态的毒性阈值及其与土壤性质间的量化关系,以期为中国Zn污染土壤的环境风险评价提供科学依据。【方法】采集了8种不同性质的农田土壤,外源添加不同浓度Zn后进行盆栽试验,利用STD1600 Epson根系扫描仪测定不同根微形态指标,结合Log-logistic剂量-效应曲线测定基于不同根微形态为终点的毒性阈值(EC10,EC50),建立基于土壤性质的Zn毒性预测模型。【结果】土壤Zn污染对不同根微形态指标的毒性阈值存在较大差异,基于大麦根尖数、总根长、根表面积和根平均直径的有机碳(EC10)和阳离子交换量EC50均值分别为228、295、335、261 mg·kg-1702、779、837、739 mg·kg-1,以根尖数测定的EC值最低,根表面积的EC值最高,即根尖数指标对土壤Zn毒性最敏感。不同土壤中,EC10值的变异系数(34.1%)大于EC50(21.6%),而4种不同测试指标中,基于大麦根表面积测定的变异系数最大,EC10和EC50的变异系数分别达到43.4%和23.2%。土壤pH、有机碳(OC)、阳离子交换量(CEC)与Zn的毒性阈值ECxx=10,50)呈正相关关系,其中pH的相关系数达到极显著水平(P<0.01)。【结论】不同的根微形态指标中,土壤Zn污染对大麦根尖的毒性最敏感;基于pH、CEC、OC的预测模型可以很好地预测土壤中Zn的大麦毒性阈值。
    大豆连作条件下施肥对东北黑土细菌群落的影响
    高圣超,关大伟,马鸣超,张伟,李俊,沈德龙
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1271-1281.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.010
    摘要 ( 125 )   HTML ( 1 )   PDF (662KB) ( 376 )   收藏
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    【目的】表征大豆连作条件下不同施肥处理土壤细菌的群落结构特征和组成差异,并侧重分析接种根瘤菌处理的不同之处;与土壤化学性质进行关联分析,探讨引起黑土细菌菌群变化的主效环境因子,为进一步了解连作条件下东北耕地土壤中细菌群落结构的变化以及大豆的高效种植和氮肥减施提供理论支持。【方法】依托5年大豆连作定位试验,选取不施肥(CK)、磷钾肥(PK)、氮磷钾肥(NPK)、磷钾肥+接种根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum 5821)处理(PK+5821)共4个处理的耕层土壤为研究对象,采用高通量测序(Illumina HiSeq)和real-time PCR技术,以16S rRNA基因V4区为分子标靶,解析不同施肥处理土壤细菌的菌群变化,并对细菌群落结构与环境因子进行相关性分析。【结果】与CK相比,施肥明显增加了大豆的产量和土壤养分的含量,但单施化肥降低了土壤的pH。接种B. japonicum 5821显著增加了土壤细菌的基因拷贝数,提高了土壤细菌的丰度。细菌门水平和纲水平的群落分析发现,变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)为土壤中的3大优势菌群,占所有优势菌门的70%以上;施肥明显降低了土壤中放线菌门的相对丰度,这与细菌纲水平的分析一致。多样性分析发现,CK处理与3个施肥处理的丰富度和多样性指数不同,且主坐标分析(PCoA)显示,3个施肥处理的细菌群落结构在PC1轴上聚在一起,而与CK处理是分开的,表明施肥明显改变了土壤细菌的群落构成。冗余分析(RDA)显示,全氮(F=3.2,P=0.002)对土壤细菌群落结构的影响最大,解释了24%的群落变化,各因子的贡献率依次为全氮>有效磷>速效钾>有机质>pH;Spearman相关性分析也表明,5项土壤化学指标均与不同优势菌门存在密切的相关关系。【结论】施肥改变了大豆连作条件下土壤细菌的群落结构。全氮是影响土壤细菌群落结构变化的主效环境因子。接种根瘤菌明显提高了大豆产量,同时保持了良好土壤化学性状和土壤菌群结构,很大程度地减少了化学氮肥的施用,对大豆的高效种植和氮肥减施具有重要意义。
    园艺
    基于CAPS标记的西瓜果实与种子相关性状QTL分析
    迟莹莹,高鹏,朱子成,栾非时,李桂英,于鹏
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1282-1293.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.011
    摘要 ( 117 )   HTML ( 1 )   PDF (3245KB) ( 266 )   收藏
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    【目的】基于西瓜全基因组重测序数据,挖掘SNP位点并将其转变为CAPS标记,构建遗传连锁图谱,对西瓜果实与种子相关性状进行QTL分析,为西瓜果实与种子相关性状主效基因精细定位及克隆奠定理论基础。【方法】以普通栽培西瓜品系(Citrullus lanatus ssp. vulgaris)‘W1-1’和黏籽西瓜品系(Citrullus lanatus ssp. mucosospermus)‘PI186490’为亲本杂交获得F1代,以‘W1-1’为轮回亲本,构建BC1P1群体。采摘成熟果实,对每个西瓜果实中心及边缘可溶性固形物、中心及边缘果肉硬度、种子百粒重、种皮底色进行调查及数据分析。对亲本材料进行覆盖度约为20×的全基因组重测序,用BWA、SAMTOOLS及VCFTOOLS等软件比对并检测亲本材料在全基因组范围内的SNP位点。运用SNP2CAPS软件选择7种在西瓜基因组上具有丰富酶切位点的限制性内切酶,对包含SNP位点的序列进行酶切位点分析,转化CAPS标记。选取全基因组范围内均匀分布的450个CAPS分子标记,筛选多态性CAPS标记,对BC1P1群体内225株分别进行基因分型,使用QTL IciMapping及Windows QTL CartographerV2.5等软件进行遗传图谱的构建和西瓜果实与种子相关性状的QTL分析。【结果】在两亲本间共获得SNP位点751 532个,根据7种限制性内切酶位点信息共开发了450个CAPS分子标记,筛选出其中具有多态性的200个CAPS标记,在225株BC1P1群体构建一张包含11个连锁群(分别对应11条染色体)的遗传连锁图谱,覆盖长度1 376.95 cM,标记间的平均遗传距离为6.88 cM。QTL分析定位到与果实与种子相关性状QTL位点15个,其中包括中心可溶性固形物含量相关位点3个(CTSS2.1CTSS2.2CTSS8.1);边缘可溶性固形物含量相关位点1个(ETSS2.1);中心果实硬度相关位点3个(CFF6.1CFF6.2CFF8.1);边缘果实硬度相关位点2个(EFF6.1EFF6.2);种皮底色相关位点4个(SCC8.1SCC8.2SCC8.3SCC8.4);种子百粒重相关位点2个(SHW6.1SHW9.1)。15个QTL位点的贡献率范围为5.25%—74.59%,贡献率大于15%的位点有5个(CTSS8.1SCC8.1SCC8.2SCC8.3SCC8.4)。【结论】共开发出SNP位点751 532个,QTL分析检测到西瓜果实与种子相关性状QTL位点15个,其中主效QTL位点5个,分别为果实中心可溶性固形物及种皮底色相关位点(CTSS8.1、SCC8.1SCC8.2SCC8.3SCC8.4),为进一步精细定位及克隆西瓜果实与种子优良性状基因奠定了基础。
    香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立
    胡春华,邓贵明,孙晓玄,左存武,李春雨,邝瑞彬,杨乔松,易干军
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1294-1301.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.012
    摘要 ( 156 )   HTML ( 2 )   PDF (1697KB) ( 832 )   收藏
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    【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLgRNA-LacZ-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9psgRNA表达盒,其中Cas9pPUbi启动子驱动,sgRNA水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。
    电阻抗断层成像评价丰花月季抗寒性
    焦美玲,弓瑞娟,钱稷,张钢
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1302-1316.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.013
    摘要 ( 100 )   HTML ( 1 )   PDF (3190KB) ( 221 )   收藏
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    【目的】研究电阻抗断层成像(electrical impedance tomography,EIT)技术评价丰花月季抗寒性的可行性,为快速、非破坏性地检测观赏植物抗寒性提供新的可借鉴方法。【方法】以3个多年生丰花月季(Rosa hybrida Hort.Floribunda’)品种‘红帽’(Hongmao)、‘柔情似水’(Rouqingsishui)、‘仙境’(Xianjing)为试材,测定当年生茎段在自然低温以及人工冷冻处理下EIT图像和电阻抗图谱(electrical impedance spectroscopy,EIS)参数的变化,并与传统电导法(electrolyte leakage,EL)测定的抗寒性进行相关分析。同时,对自然低温下3个丰花月季品种茎的胞外电阻率re、胞内电阻率ri、弛豫时间t和弛豫时间分布系数y四个EIS参数与EIT重构值进行相关性分析。【结果】3个丰花月季品种在最冷月抗寒性顺序为:‘仙境’>‘柔情似水’>‘红帽’;各个品种不同温度下的茎段都可以得到清晰的EIT图像,且EIT重构值随温度降低呈减小的趋势,通过EIT重构值计算的抗寒性与电导法求得的抗寒性有极显著的相关性(r=0.92),但较EL法测得的抗寒性低。抗寒锻炼期间,EIS参数均发生变化,总体上,胞外电阻率re呈上升趋势,弛豫时间t呈下降的趋势;自然低温下,‘红帽’和‘仙境’的胞外电阻率re与EIT重构值正相关(r>0.72),‘柔情似水’和‘仙境’的弛豫时间t同样和EIT重构值正相关(r0.63),说明EIT重构值、ret可以表征细胞、组织的状态。【结论】冷冻处理下,丰花月季枝条受到冻害以后,EIT图像重构值显著降低,可以通过重构值用Logistic方程拟合计算,得到抗寒性,但是所得抗寒性较EL法低。未经冷冻处理的胞外电阻率re和弛豫时间t两个EIS参数与EIT重构值有一定的相关性。样本经冷冻处理后,可以用茎的电阻抗断层成像(EIT)图像重构值评价丰花月季的抗寒性。
    食品科学与工程
    消费者膳食中二氧化硫残留的累积性风险评估
    胡桂仙,赖爱萍,袁玉伟,张志恒,赵首萍,朱加虹,王强
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1317-1325.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.014
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     【目的】明确不同食物源中的二氧化硫残留累积暴露风险,为硫磺或亚硫酸盐类(以二氧化硫残留计)在水果、蔬菜等产品中的使用及其二氧化硫残留限量的制定提供科学依据。【方法】采集生产及流通环节的各类食品(包括农产品),共计3 299个样品,参照GB/T 5009.34—2003《食品中亚硫酸盐的测定》方法进行二氧化硫残留量检测。结合文献资料中淀粉、酒类、食用菌及藻类罐头等408个样品的二氧化硫残留数据,基于残留均值、人均消费量及体重数据,采用点评估方法评估中国不同人群的二氧化硫累积性膳食暴露风险。【结果】在27种食品中,腌渍的蔬菜、蔬菜罐头(仅限竹笋、酸菜)、水果干类及食用淀粉的残留均值分别为148.92、147.36、191.21和41.57 mg·kg-1,均超过了GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中允许的最大使用量,其中蔬菜罐头(仅限竹笋和酸菜)的残留均值是允许使用量的2.9倍,水果干类是1.9倍,腌渍的蔬菜是1.5倍,食用淀粉是1.4倍。通过风险评估可知,由于这4类食品的消费量较低,其风险程度均在人体可接受范围内;尽管蔬菜中二氧化硫的膳食暴露风险商高于其他食物类别,但其风险商仅为0.124,仍小于1,处于安全水平,不会对消费者产生健康风险;从平均残留水平得到的风险商来看,不同年龄段人群的风险商均小于1,而P95和P97.5位点值时,2—3岁、4—6岁、7—10岁和11—13岁4个年龄组的膳食风险商已大于或近似于1,说明在该年龄段,二氧化硫的膳食风险对健康造成了一定威胁。【结论】建议消费腌渍蔬菜、蔬菜罐头(仅限竹笋、酸菜)、水果干类及食用淀粉的人群适当控制这4类食品的摄入量;对二氧化硫的膳食高风险人群(2—13岁)应控制其饮食中二氧化硫的摄入量,尤其是减少腌菜类食品的消费量,降低膳食风险;建议对未做明确使用规定的农产品尤其是部分新鲜蔬菜,开展二氧化硫残留的安全性再评价,结合产业需求、产品本底等客观因素,系统性修订二氧化硫的限量标准或增加食品添加剂的使用范围。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    外源蛋白酶对肉鸡饲粮体外干物质消化率和酶水解物能值的影响
    张立兰,陈亮,钟儒清,张宏福
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1326-1333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.015
    摘要 ( 64 )   HTML ( 2 )   PDF (381KB) ( 271 )   收藏
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    【目的】研究外源蛋白酶对肉鸡饲粮体外干物质消化率(DMD)和酶水解物能值(EHGE)的影响,并使用仿生法获取饲粮中外源蛋白酶的最适添加量,为饲用酶制剂效价快速评价方法的建立提供理论参考。【方法】试验采用单因素完全随机设计,对照组分别为肉鸡前期和后期基础饲粮(粗蛋白质水平分别为:24.29%和21.72%,干物质基础),试验组分别在肉鸡前期和后期基础饲粮中添加0、15 000、75 000和150 000 PROT·kg-1的外源蛋白酶,试验共8种饲粮样品,每种饲粮样品设5个重复,每个重复1根仿生消化管,使用单胃动物仿生消化系统(SDS-II)分别模拟饲粮在鸡的胃和胃—肠道的消化过程,测试并计算饲粮样品的DMD、体外能量消化率(GED)和EHGE,分别建立DMD和EHGE与蛋白酶添加量(protease supplementation, PS)的回归方程,并分析DMD和EHGE与PS的相关关系。【结果】随着外源蛋白酶添加剂量的增加,肉鸡前期和后期基础饲粮全消化道DMD、GED和EHGE也随之增加(P<0.01)。随着在肉鸡后期基础饲粮中外源蛋白酶添加剂量的增加,胃消化阶段的DMD和GED随之降低(P<0.01)。而在肉鸡前期基础饲粮中添加外源蛋白酶,对胃消化阶段的DMD、GED和EHGE影响不显著(P>0.05)。肉鸡前期基础饲粮全消化道DMD (%)和PS (g·kg-1)的关系为:DMD (%) =2.56 PS-0.82 PS ×PS+73.90 (R2=0.82, RSD = 0.42, P<0.001);EHGE (MJ·kg-1)和PS (g·kg-1) 的关系为:EHGE (MJ·kg-1) = 0.75 PS - 0.30 PS × PS + 15.02 (R =0.89, RSD=0.07, P<0.001);当外源蛋白酶添加剂量为112 500 PROT·kg-1时,肉鸡前期基础饲粮全消化道EHGE达到最大值。肉鸡后期基础饲粮全消化道DMD (%)和PS (g·kg-1)的关系为:DMD (%) = 3.56 PS-1.46 PS ×PS+75.20 (R2 = 0.70, RSD = 0.60, P<0.001);EHGE (MJ·kg-1)和PS (g·kg-1)的关系为:EHGE (MJ·kg-1) = 0.61 PS-0.30 PS×PS + 15.67 (R2 = 0.79, RSD = 0.06, P<0.001),当外源蛋白酶添加剂量为91 800 PROT·kg-1时,肉鸡后期基础饲粮全消化道的EHGE达到最大值。【结论】玉米-豆粕基础饲粮中添加外源蛋白酶,可显著提高肉鸡基础饲粮体外全消化道DMD、GED和EHGE。但外源蛋白酶的添加剂量对不同消化道阶段和不同营养指标消化率的影响并不呈单纯一致的剂量反应规律。本试验条件下,肉鸡前期和后期基础饲粮中分别添加112 500和91 800 PROT·kg-1的蛋白酶时EHGE提升效果最好。
    GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成
    赵兵令,李亚楠,陈天直,刘颖,常露程,范瑞文,薛霖莉,王海东,董常生
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1334-1342.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.016
    摘要 ( 72 )   HTML ( 1 )   PDF (2418KB) ( 258 )   收藏
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    【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认。使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体。通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB。观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量。【结果】与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5 μg DNA/孔转染效率最高。相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P<0.01)。与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P<0.01)。Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P<0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P<0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P<0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P<0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显。Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P<0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P<0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P<0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P<0.05);TYRP1蛋白升高1.05 倍,但变化不明显。【结论】 GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成。
    研究简报
    甜橙和柚中CTV强弱毒株系p20的遗传变异
    王亚飞,阮涛,周彦,王雪峰,吴根土,孙现超,周常勇,青玲
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1343-1350.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.017
    摘要 ( 57 )   HTML ( 1 )   PDF (400KB) ( 167 )   收藏
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    【目的】对7个柑橘衰退病毒(CTV)株系进行遗传变异研究,明确寄主甜橙和柚中CTV强弱毒株系p20的变异水平。【方法】运用RT-PCR、克隆及测序等技术建立CTV p20种群,并借助MEGA6构建单倍型系统发育树,运用软件DNAStar对两种寄主中CTV强弱毒种群的遗传结构、变异水平进行分析,运用DnaSP软件对各种群进行单倍型多样性、核苷酸多样性分析和中性检验分析。【结果】构建了7个CTV p20种群,由162条序列构成,包含11个单倍型,单个种群有1个或更多单倍型出现。序列分析发现,来自不同种群的单倍型对应的原始核苷酸序列一致性为88.2%—100.0%,对应的氨基酸序列的一致性为92.3%—100.0%,最低的氨基酸序列一致性发生在CT23-1和CT9-2之间;其中单倍型PeraIAC-4、CT22和CT9-1共有50条序列,对应的原始核苷酸序列一致性为100.0%,属优势单倍型,与标准株系T36亲缘关系较近;单倍型多样性最丰富的是甜橙种群PeraIAC,单倍型多样性为0.800,而单倍型多样性最低的是柚种群CT22,单倍型多样性为0.170;相比柚种群的单倍型多样性(0.170—0.552)和核苷酸多样性(0.00032—0.05919),甜橙种群具有更为丰富的单倍型多样性(0.513—0.800)和核苷酸多样性(0.04208—0.05677)。系统发育树分析表明,来自甜橙的分离株种群结构复杂,甜橙种群中检测到的单倍型与标准株系T30、T36、VT和T3均有相关性;与标准株系T3相距很近的CT31-2与优势单倍型在系统发育树上距离最远,对应的原始核苷酸序列一致性仅为88.3%。中性检验结果表明,CTV甜橙种群趋于平衡或收缩状态,而CTV柚种群除CT23外则趋于扩张状态;其中TR-514Y、CT31和CT23种群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均为正值且达到显著水平,而CT9种群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均为负值且达到显著水平。运用DnaSP软件对各种群进行重组分析表明,在各种群中均未检测到重组事件发生。种群变异分析发现,各种群突变克隆百分比在0—30.8%,碱基突变频率在0—7.706×10-4,其中CTV甜橙强毒种群有最高的突变克隆百分比(30.8%),最高的碱基突变频率(7.706×10-4),最多的碱基突变数量(11个)和最多的突变位点(7个);CTV甜橙弱毒种群的突变克隆百分比和碱基突变频率均明显低于甜橙强毒种群,CTV柚弱毒种群的突变克隆百分比和碱基突变频率略低于柚强毒种群。碱基突变类型分析发现碱基突变以碱基替代为主,其中A→G突变为优势类型,仅在柚强毒种群CT3的156和157位点间检测到一个碱基插入突变类型,为碱基A插入,未检测到碱基缺失突变类型。【结论】在寄主甜橙和柚中CTV强弱毒p20种群结构及变异存在差异,CTV甜橙种群有着更复杂的种群结构和更高的种群变异水平,且CTV强毒种群变异更大。
    棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备
    魏原杰,王亚美,黄丽娜,刘宁,赵洁,艾新宇,刘小宁
    中国农业科学. 2017, 50(7):  1351-1360.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.07.018
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    【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii) P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 kD,理论等电点为8.99,通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 kD,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1﹕409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性。【结论】利用3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用。