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当期目录

    2016年 第49卷 第14期 刊出日期:2016-07-16
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    酵母耐盐相关基因HAL1在棉花中的功能表达
    穆 敏,舒 娜,王 帅,郭丽雪,樊伟丽,阴祖军,王俊娟,王德龙,叶武威
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2651-2661.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.001
    摘要 ( 297 )   HTML ( 1 )   PDF (6543KB) ( 521 )   收藏
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    【目的】克隆酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)耐盐基因HAL1(halotolerance)并转化棉花,探究该基因在棉花中的功能,进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的具体功能。【方法】根据NCBI核酸数据库中酵母耐盐基因HAL1的mRNA全长序列信息,利用RT-PCR技术从酿酒酵母As2.375中克隆该基因。选择酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ对表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion技术构建pBI121-ScHAL1::GFP融合表达载体。以自发荧光较弱的陆地棉品种Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉为材料,用基因枪轰击棉花花粉进行瞬时表达研究。采用基因枪活体转化技术将外源基因表达载体pBI121-HAL1::GFP转化棉花盐敏感材料中s9612,获得T0棉花转基因种子。用100 mmol·L-1 NaCl盐溶液对转基因T0种子进行耐盐性发芽试验,并进行分子检测,对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析。【结果】从酿酒酵母As2.375中克隆耐盐基因ScHAL1,基因全长885 bp,共编码294个氨基酸。对其序列进行分析,发现HAL1蛋白中丝氨酸所占比例最大,整个蛋白呈碱性且带正电,属于亲水性蛋白。根据蛋白二级结构预测结果,推测该蛋白的结构功能域可能主要由无规则卷曲和β-折叠片构成。棉花花粉瞬时表达结果表明,转化HAL1后,3种陆地棉花粉的绿色荧光现象都明显增强,说明该基因可以在这3种陆地棉的花粉中表达。用100 mmol·L-1 NaCl盐溶液对转基因棉花T0种子和受体材料中s9612自交种进行胁迫,发现转基因种子萌发能力明显强于受体材料,表明HAL1可以提高种子耐盐性。根据基因核苷酸序列设计2对引物对T0转基因棉花幼苗进行分子检测,将纯化后的PCR产物进行直接测序,测序结果证明转基因成功。对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析发现,在600 mmol·L-1 NaCl和400 mmol·L-1 NaCl盐胁迫下转基因植株叶盘叶绿素含量均高于对照植株,且在600 mmol·L-1 NaCl溶液胁迫后,转HAL1植株叶绿素含量反而高于400 mmol·L-1 NaCl溶液处理后的叶盘。【结论】成功从酿酒酵母中克隆基因HAL1,酵母HAL1对提高棉花耐盐性具有重要作用。
    甘蔗独脚金内酯生物合成基因ScCCD8的克隆与表达分析
    吴转娣,刘新龙,刘家勇,昝逢刚,赵培方,林秀琴,陈学宽,苏火生,刘洪博,吴才文
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2662-2674.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.002
    摘要 ( 252 )   HTML ( 1 )   PDF (6809KB) ( 464 )   收藏
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    【目的】克隆甘蔗的ScCCD8,分析其序列特征并预测其功能,研究在甘蔗不同组织部位、不同胁迫处理条件以及不同生长时间点ScCCD8的表达情况,为该基因在甘蔗基因工程育种中的应用提供理论支撑。【方法】以NCBI中检索的甘蔗CCD8同源片段EST序列为模板设计引物,扩增甘蔗CCD8的片段,采用RACE和RT-PCR技术分别从甘蔗品种新台糖22号中克隆CCD8的5′、3′目的片段和全长cDNA序列,以生物信息学方法对序列进行预测分析,利用qRT-PCR方法分析CCD8在不同组织、不同逆境胁迫条件下和不同生长时间点的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗CCD8,命名为ScCCD8,GenBank登录号为KP742973.1。该cDNA全长2 016 bp,含有1个1 623 bp的完整开放阅读框(ORF),编码540个氨基酸,编码的蛋白质分子量为59.534 kD。生物信息学分析表明ScCCD8编码的蛋白是定位于叶绿体上的非分泌性蛋白,不是典型的跨膜蛋白,没有信号肽位点。存在着多个糖基化位点和磷酸化位点等活性位点。序列分析表明,ScCCD8与其他植物的CCD8蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScCCD8与高粱的CCD8蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,ScCCD8的表达具有组织特异性,在根中的表达量最高,是老叶中表达量的18倍。其在模拟重度干旱胁迫(20% PEG)、盐胁迫(200 mmol·L-1 NaCl)、磷缺乏(1/8 mmol·L-1)和营养缺乏(纯水培养)4种胁迫处理下,茎尖中的ScCCD8均被诱导表达,且在处理24 h以后,ScCCD8的表达量增加较为明显。在不同生长时期,ScCCD8在甘蔗不同生长时期的茎尖中均有表达,且在幼苗期的表达量高于萌芽期和分蘖期。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得的甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScCCD8是CCD8基因家族成员,推测ScCCD8可能与甘蔗SLs响应逆境胁迫有关。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    微喷补灌对冬小麦旗叶衰老和光合特性及产量和水分利用效率的影响
    徐学欣,王东
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2675-2686.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.003
    摘要 ( 257 )   HTML ( 1 )   PDF (503KB) ( 572 )   收藏
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    【目的】探明微喷补灌对冬小麦开花后旗叶衰老和光合特性、籽粒灌浆速率、产量和水分利用效率的影响,为小麦节水高产提供重要技术支持。【方法】于2011—2013年冬小麦生长季,选用高产冬小麦品种济麦22,设置全生育期不灌水(W0)、微喷补灌(W1)和传统畦灌(W2)处理,研究小麦开花后旗叶水势、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性、叶绿素荧光参数、群体光合速率和籽粒灌浆速率等的差异。W1与W2处理的灌水时期一致,均于小麦拔节期和开花期各灌水1次。W1处理采用小麦专用微喷带(ZL201220356553.7)补充灌溉,灌水前测定土壤含水量。两年度小麦拔节期均设定0—140 cm土层土壤目标相对含水量为70%,第一年和第二年小麦开花期设定0—140 cm土层土壤目标相对含水量分别为70%和65%,根据灌水定额公式计算所需补灌水量。W2处理采用传统畦灌方式灌溉,改口成数为90%,即当水流前锋到达畦长长度的90%位置时停止灌水,用水表计量实际灌水量。W1与W2处理试验小区的规格一致,畦宽(左侧畦梗中心线至右侧畦梗中心线的垂直距离)2 m,畦梗宽0.4 m,畦长60 m,面积120 m2。小区间设1.0 m保护行。每小区等行距种植8行小麦,实际行距22.9 cm。W1处理的每个试验小区在自边行向内数第4行与第5行小麦之间沿小麦种植行向(畦长方向)铺设一条专用微喷带。微喷带进水端装有压力表、水表和闸阀,进水端水压设为0.02 MPa。灌溉水水源为井水,从水源至微喷带和畦田进水端采用PVC水龙带输水。畦灌的单宽流量为4.6—5.2 L·m-1·s-1。【结果】两年度微喷补灌处理在小麦拔节期和开花期的补灌水量分别为21.3—96.0 mm和29.0—38.5 mm,灌水分布均匀系数达87.9%—97.0%,不低于传统畦灌处理,而全生育期总灌水量比传统畦灌处理减少33.2—70.8 mm,节水21.0%—54.2%。微喷补灌处理开花后旗叶水势、SOD和CAT活性、丙二醛含量、旗叶最大光化学效率、实际光化学效率,及群体光合速率和籽粒灌浆速率、籽粒产量均与全生育期灌2水的传统畦灌处理无显著差异,但水分利用效率提高2.1—2.9 kg·hm-2·mm-1,达21.6—23.2 kg·hm-2·mm-1。【结论】小麦拔节期和开花期微喷补灌可以根据灌水前的降水量和土壤含水量状况及时调节补灌水量,并实施精确、均匀灌溉,适量供给小麦高产生理需水,挖掘出小麦节水的更大潜力。
    不同氮肥水平下玉米根际土壤特性与产量的关系
    张学林,徐 钧,安婷婷,侯小畔,李潮海
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2687-2699.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.004
    摘要 ( 372 )   HTML ( 1 )   PDF (819KB) ( 765 )   收藏
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    【目的】明确不同生育时期根际土壤特性与玉米籽粒产量之间的关系,能够为生产上合理施肥、提高氮素利用效率和减轻环境污染提供理论依据。【方法】2012年大田设置5个氮肥梯度固定施肥样地(对照、180 kg·hm-2、240 kg·hm-2、300 kg·hm-2和360 kg·hm-2,分别简写为CK、N180、N240、N300和N360),并于2012、2013和2014年连续3年在玉米拔节、吐丝、成熟3个关键生育时期测定玉米根际和非根际土壤铵态氮、硝态氮、脲酶、过氧化氢酶、pH,同时测定玉米根系和地上部生物量及其氮素累积量,重点分析CK、N240和N360 3个处理根际土壤特性以及植株氮素累积量与玉米籽粒产量之间的关系。【结果】与CK相比,4个施肥处理(N180、N240、N300和N360)3年产量的平均值分别增加了23.85%、36.40%、39.87%和34.78%;其地上部不同阶段氮素累积量均显著高于CK(2012年播种—拔节除外),并随施肥量增加呈先增加后降低趋势。与CK相比,4个施肥处理根际土硝态氮含量分别增加23.38%、57.13%、57.87%和69.74%,非根际土壤硝态氮分别增加59.49%、92.01%、132.08%和179.35%。随施氮量的增加根际土铵态氮含量显著增加;与CK相比,4个施肥处理3年的非根际土壤铵态氮含量分别增加4.27%、3.51%、5.04%和26.26%。根际土壤pH和非根际土壤pH均随着氮肥施用量的增加而降低,其中根际土壤和非根际土壤pH的变化范围分别为4.5—6.7和5.5—7.2。与非根际土pH相比,根际土壤pH平均降低5%。根际土壤脲酶活性随氮肥用量的增加呈先增加后降低趋势。与对照相比,4个施氮处理3年非根际土壤脲酶活性平均值分别增加了4.02%、14.73%、24.55%和19.64%。根际土和非根际土过氧化氢酶活性均随氮肥用量的增加而降低,与CK相比,4个施氮处理3年的非根际土壤过氧化氢酶活性平均值分别降低了3.03%、5.09%、8.24%和12.67%。CK、N240和N360 3个处理不同生育时期玉米根际土壤特性以及植株氮素累积量与籽粒产量之间的相关分析结果表明,拔节期根际土壤硝态氮含量连续3年均与产量呈显著正相关。吐丝期玉米根际和非根际土壤硝态氮、根际土壤铵态氮和非根际土pH均与籽粒产量呈显著正相关;其中2013和2014年根际脲酶活性和根际土壤pH与产量的相关性也达到显著水平。2013和2014年成熟期根际和非根际土硝态氮含量也与玉米产量呈显著相关。主成分分析表明,玉米籽粒产量与拔节期土壤硝态氮含量、根际过氧化氢酶、地上部生物量和氮素累积量相关性较强;与吐丝期根际和非根际土壤硝态氮含量、根际土壤铵态氮含量和土壤pH以及地上部生物量及氮素累积量、根系生物量相关性较强;与成熟期地上部生物量和氮素累积量相关性较强。【结论】根据不同生育时期玉米根际土壤特性与籽粒产量之间的关系,进行合理施肥,能够保证玉米根际养分的有效供应,营造良好的根际土壤环境,提高氮素利用效率、增加玉米籽粒产量。
    植物保护
    8%甲氰菊酯·丁氟螨酯纳米乳剂的研制及其性能
    赵恒科,蓝 月,南 灿,胡 月,饶 萍,田 亚,严 伟,钱 坤,何 林
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2700-2710.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.005
    摘要 ( 261 )   HTML ( 1 )   PDF (1479KB) ( 330 )   收藏
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    【目的】农药复配可扩大防治谱、降低单剂用药量和生产成本,延长药剂使用寿命。开发能耗低、稳定性好的纳米乳剂,使农药有效成分可以通过剂型加工更好地发挥其生物效果,提高药效。【方法】采用药膜法测定两种杀虫杀螨剂甲氰菊酯、丁氟螨酯对朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)的毒力,采用共毒因子法评价两个药剂的增效作用,共毒系数法进行复配农药最佳配比筛选,最后对配比与共毒系数进行数学模型方程拟合对最佳配比进行筛选;并在获得最佳配比的基础上采用低能乳化法加工成8%甲氰菊酯·丁氟螨酯纳米乳剂,根据联合国粮农组织纳米乳剂特性及基本要求,进行8%甲氰菊酯·丁氟螨酯纳米乳剂质量控制指标检测;并通过接触角和黏附功的测定初步探究纳米乳剂的性能。【结果】药膜法测定甲氰菊酯、丁氟螨酯处理朱砂叶螨雌成螨24 h后LC50分别为711.62、4.32 mg·L-1,共毒因子法测定结果表明,甲氰菊酯和丁氟螨酯复配在质量比18﹕1和165﹕1之间具有增效作用,增效配比区间较宽,两者复配可行。共毒系数法结果表明,甲氰菊酯与丁氟螨酯的质量比为50﹕1时,共毒系数(CTC)最高,CTC=209.96。通过方程拟合,甲氰菊酯·丁氟螨酯配比与共毒系数的数学模型为y=-216.86x2+19201x-424807,R2=0.864,理论最佳配比约为39﹕1(质量比),CTC=211.91,进一步通过共毒系数法对理论最佳配比验证得:甲氰菊酯﹕丁氟螨酯=39﹕1时,毒力回归方程为y=0.66x+3.8,r=0.9757,LC50=60.96 mg·L-1,共毒系数(CTC)高达215.36。由以上结果可知理论最佳配比与实际最佳配比增效作用基本一致,说明筛选的甲氰菊酯和丁氟螨酯最佳配比具有实际可靠性。最终确定39﹕1(甲氰菊酯﹕丁氟螨酯质量比)为最佳配比进行纳米乳剂的研制。通过溶剂、乳化剂、水质的筛选,得到8%甲氰菊酯·丁氟螨酯纳米乳剂的最佳制剂配方,优化配方为:甲氰菊酯7.8%,丁氟螨酯0.2%,溶剂10%(溶剂油S-150#﹕二甲苯=4﹕1),乳化剂9%—11%(十二烷基苯磺酸钙﹕聚氧乙烯脂肪酸酯=2﹕3),丙三醇2%,水补足至100%。所研制8%甲氰菊酯·丁氟螨酯纳米乳剂外观呈透明均相液体,乳液稳定性、低温稳定性、热贮稳定性、经时稳定性等指标均合格,稀释200倍呈淡蓝色均相透明液体且分散性良好。8%甲氰菊酯·丁氟螨酯纳米乳剂与两种单剂相比接触角更小,黏附功大,纳米乳液雾滴与靶标结合得更加牢固,药液不容易从靶标上洒落,更有利于植物对药液的吸收,可提高药效。【结论】采用共毒因子法、共毒系数法与拟合方程相结合进行最佳配比的筛选,其结果可以更全面、客观地反映出二元复配剂的增效情况,对农药复配有一定的指导价值,同时纳米乳剂的引入对于改善当前农药剂型结构具有重要意义。
    西瓜花叶病毒(WMV)单克隆抗体的制备及其应用
    陈 浙,宋 革,周雪平,吴建祥
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2711-2724.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.006
    摘要 ( 144 )   HTML ( 1 )   PDF (2456KB) ( 285 )   收藏
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    【目的】制备抗西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)的特异性单克隆抗体,并以其为核心建立能快速有效地检测WMV的血清学方法,从而为中国田间西瓜花叶病毒病的诊断和检测、预测预警及科学防控体系的建立提供物质和技术支撑。【方法】用提纯的WMV病毒粒子免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和细胞培养、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,获得能稳定分泌抗WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔制备其单抗腹水,并以制备的单抗为核心建立能准确、特异、灵敏地检测田间植物中WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法,以及能检测单头传毒介体蚜虫体内WMV的dot-ELISA方法。【结果】3株能稳定分泌WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8、15A8和16C12)及其单抗腹水被制备,3株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价均达到了10-6以上,抗体类型及亚类均为IgG1、kappa轻链。Western blot分析发现,这3个单抗均与WMV的外壳蛋白亚基有特异性反应。灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR方法检测WMV病叶的灵敏度分别达到1﹕163 840、1﹕327 680、1﹕5 120和1﹕1 310 720倍稀释(w/v,g/mL)。特异性分析结果表明,以这3个单抗为核心建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 5种血清学检测方法均能与感染WMV的病叶发生特异性免疫反应,而与感染小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的植物样品、健康白南瓜、西瓜、葫芦和烟草的植物组织均呈阴性反应,且dot-ELISA方法还能特异性地检测单头蚜虫体内的WMV,而在检测无毒蚜虫时呈阴性反应。利用建立的血清学检测方法对采自浙江省、江苏省、山东省和海南省的275株葫芦科疑似病株进行检测,结果发现187株植物感染WMV,发病率达68%,说明WMV在中国田间葫芦科植物中广泛流行发生,且血清学方法的检测结果与RT-PCR方法的检测结果完全一致,将部分PCR产物进行核酸测序和序列比对分析,结果表明这些PCR产物是WMV CP基因片段,证明血清学方法检测阳性的样品确实感染WMV。【结论】获得了3株特异、灵敏的WMV单克隆抗体,以其为核心建立的5种血清学方法能准确、灵敏、可靠地应用于田间样品中WMV的检测,从而为中国WMV田间样品的大规模快速检测和诊断、该病害预报预警和科学防控提供物质和技术支撑。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    氮肥管理和秸秆腐熟剂对15N标记玉米秸秆氮有效性与去向的影响
     
    丁文成,李书田,黄绍敏
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2725-2736.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.007
    摘要 ( 235 )   HTML ( 1 )   PDF (370KB) ( 431 )   收藏
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    【目的】研究氮肥用量、有机无机配合和添加秸秆腐熟剂对秸秆氮当季有效性、后效及去向的影响,为秸秆还田条件下的氮肥管理提供理论依据。【方法】运用15N同位素示踪技术,采用盆栽试验连续种植一季冬小麦和两茬玉米,研究15N标记玉米秸秆(15N-秸秆)氮的生物有效性和对土壤氮库的贡献。试验推荐施氮量210 kg N·hm-2,约0.1 g N·kg-1土,秸秆粉碎后按3.0 g·kg-1土掺入每盆中。设4个氮水平:不施氮;100%化肥氮;80%化肥氮;有机无机配施(80%化肥氮+20%腐熟猪粪氮)。各施氮水平下设添加和不添加秸秆腐熟剂2种情况,腐熟剂用量为0.1 g·kg-1土。【结果】冬小麦吸氮量来自15N-秸秆氮的比例(%Ndfs)为6.30%—14.25%,施氮比不施氮减少%Ndfs,有机无机配施比单施氮肥提高%Ndfs,添加腐熟剂不影响冬小麦的%Ndfs。第一茬和第二茬玉米吸收氮的%Ndfs分别为1.13%—3.73%和1.67%—5.97%,不施氮高于施氮处理,施氮处理间无显著差异,添加腐熟剂降低%Ndfs。冬小麦对15N-秸秆氮的当季利用率为7.14%—10.32%,第一茬玉米和第二茬玉米对残留15N-秸秆的利用率分别为3.75%—5.51%和2.28%—3.18%。三茬后作物对15N-秸秆氮的利用率为13.13%—18.60%,土壤残留率55.63%—69.16%,损失率17.26%—26.09%。三茬中施氮比不施氮提高15N-秸秆氮的利用率,不同氮肥管理不影响当季利用率和第二茬后效,氮肥减量(80%推荐氮)降低15N-秸秆氮第一茬后效和总利用率,但若配施有机肥则提高利用率。添加腐熟剂提高15N-秸秆氮当季、第一茬玉米和三茬总利用率,降残留率和损失率。冬小麦和两茬玉米收获后土壤矿质氮和微生物量氮含量变化较大,但其来源于15N-秸秆氮的比例都小于3%,施氮处理的影响不明显,而添加腐熟剂增加冬小麦和第一茬玉米收获后土壤矿质氮%Ndfs,减少土壤微生物量氮%Ndfs,不影响第二茬玉米收获后土壤矿质氮和微生物量氮%Ndfs。三茬收获后残留的15N-秸秆氮中矿质氮和微生物量氮也小于3%,说明残留在土壤中的15N-秸秆氮主要以有机态氮存在。【结论】在秸秆还田条件下,采用化肥氮与有机肥氮配施并结合施用秸秆腐熟剂是提高秸秆氮素转化和有效性的有效措施。
    局部恢复水氮供应对玉米根系氮素吸收与分配的影响
    牛晓丽,胡田田,张富仓,王 丽,刘 杰,冯璞玉,杨硕欢,宋 雪
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2737-2750.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.008
    摘要 ( 203 )   HTML ( 1 )   PDF (441KB) ( 399 )   收藏
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    【目的】水分或养分胁迫后恢复供应能显著提高根系吸收能力,且局部水分或氮素供应可以有效刺激供应区根系吸收的补偿效应,进一步揭示水氮双重胁迫后局部恢复供应条件下影响根系氮素吸收能力的因素以及玉米各器官氮素分配状况有重要意义。【方法】采用分根技术,水培模拟局部根区水氮同时恢复供应,其中以聚乙二醇6000(PEG 6000)模拟营养液的渗透势,并用相应的供氮水平模拟氮素胁迫。试验设置4个水氮双重胁迫(也即4个局部恢复供应)处理:正常供应水氮、轻度水氮胁迫、中度水氮胁迫和重度水氮胁迫。双重胁迫6 d后一半根区恢复正常供应,于处理后0、1、3、5、7、9 d连续动态监测各根区根系氮素吸收速率、含氮量以及氮素累积量。【结果】水氮双重胁迫后局部恢复供应,持续胁迫区根系吸收速率、含氮量以及氮素累积量均显著小于恢复供应区(P<0.05)。1—3 d时,轻度和中度胁迫处理持续胁迫区根系氮素吸收速率比恢复供应区分别减小38.2%和48.7%;7—9 d时分别减小84.9%和86.4%。对于恢复供应区,局部水氮同时恢复供应1 d内,根系氮素吸收速率较前期胁迫明显增大,且在0—1 d和7—9 d时,经中度及其以下胁迫程度时,根系氮素吸收速率显著大于对照(P<0.05),产生根系氮素吸收能力的补偿效应,但3—7 d 时消失。而且,恢复供应区根系含氮量和氮素累积量分别于1 d和5 d后恢复到对照水平,导致植株氮素生产效率最终与对照无显著差异。另外,各处理地上部氮素来自15N肥料的分配比例显著小于对照(P<0.05),且随胁迫程度而逐渐减小,恢复供应区根系则有相反的规律,持续胁迫区根系表现为,轻度胁迫与对照无明显差异(P>0.05),中度和重度胁迫显著大于对照和轻度胁迫(P<0.05),且3—9 d时,中度和重度胁迫间无明显差异(P>0.05)。【结论】前期中度以下程度(水分−0.4 MPa+氮素1 mmol·L-1)的水氮双重胁迫后局部恢复供应,恢复供应区根系氮素吸收速率在时间和空间上均可得到恢复,产生根系氮素吸收的部分补偿效应,但这种补偿效应与恢复供应的时间有关(轻度胁迫为1 d,中度胁迫为7 d);玉米各器官氮素分配比例与胁迫程度和局部恢复供应时间有关。该研究可为调节植物与土壤环境的相互作用,充分挖掘植物自身对环境变化的适应潜力提供理论依据。
    河套灌区春小麦生产水足迹影响因子敏感性及贡献率分析
    孙世坤,刘文艳,刘 静,王玉宝,陈帝伊,吴普特
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2751-2762.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.009
    摘要 ( 202 )   HTML ( 1 )   PDF (1075KB) ( 386 )   收藏
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    【目的】农业水资源高效利用是保障国家粮食和水资源安全的重要途径,作物用水评价是农业用水管理的主要研究课题之一。水足迹为农业用水评价提供了新的指标体系,对作物生产水足迹影响因素进行定量评价有助于进行水足迹调控,实现农业水资源高效利用。【方法】以河套灌区为研究区域,基于水足迹概念体系,利用改进的水足迹量化方法对河套灌区春小麦生产水足迹进行量化并分析其在研究时段内的演变特征;利用单因素轮换(One-At-A-Time,OAT)敏感性分析方法和贡献率分析方法探究气候、农业生产投入因子和水资源利用效率对春小麦生产水足迹变化的驱动力。【结果】春小麦生产水足迹在研究时段内呈显著下降趋势,从1981年的4.71 m3·kg-1,下降到2010年的1.52 m3·kg-1;同时年际变化呈现出较为明显的阶段性特征,可划分为波动性下降期(1981—1987年)、快速下降期(1988—1995年)、缓慢下降期(1996—2010年),该变化规律与灌区农业生产和灌溉水平的发展特征基本一致;从水足迹的蓝、绿水构成来看,河套灌区春小麦生产水足迹中蓝水足迹比例超过90%,而绿水足迹比例不足10%,这与灌区农业生产用水特征相一致。敏感性分析显示,水足迹对各个因子的敏感性差别十分显著,日照时数、相对湿度、降水量、灌溉水利用系数和单位面积化肥用量在±20%波动的情况下,春小麦生产水足迹的波动范围分别为±30%、±24%、±2%、±63%和±4%,春小麦生产水足迹对灌溉水利用系数、日照时数和相对湿度的敏感性较高,对其余影响因子的敏感性较低。贡献率分析显示,研究时段内相对湿度的减少和降水量的增加促使春小麦生产水足迹的增加。而日照时数的下降、化肥使用量以及灌区用水效率的提高促使了春小麦生产水足迹的降低。定量分析结果显示,化肥和灌溉水利用系数对春小麦生产水足迹变化的贡献率分别为-36.89%和-39.42%,而气候因子的综合贡献率仅为2.80%,对研究时段内春小麦生产水足迹下降贡献率最大的是灌溉水利用系数,其次为单位面积化肥用量,而相对湿度、日照时数和降水量三者的贡献率相近,贡献率最小的是日照时数,这主要是因为日照时数在研究时段内的变率较小。【结论】气候、农业生产资料投入和水资源利用效率是影响作物生产水足迹的主要因素,就河套灌区而言,农业生产资料投入和水资源利用效率的提高是促使灌区春小麦生产水足迹下降的主要因素,而气候因子在研究时段内对春小麦生产水足迹的影响较小。该研究结果可为水足迹调控提供理论依据与实践参考。
    园艺
    CBF冷应答途径基因在热处理诱导的香蕉果实抗冷性中的作用
    王海波,李璐,苏新国,张昭其,庞学群
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2763-2771.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.010
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    【目的】探讨CBF/DREB(C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element binding factor)冷应答途径在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用,为研究香蕉果实中CBF冷应答途径的信号转导过程提供参考依据。【方法】从香蕉基因组数据库(http://banana-hub.southgreen.fr/)中挑选CBF冷应答途径的7个基因序列,分别设计特异引物,利用实时荧光定量 PCR分析这7个基因在热处理诱导的香蕉抗冷性中的表达模式。【结果】香蕉果实MaICE在7℃处理1 h时,表达迅速升高并达到最大值,DREB类基因(MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G和MaDREB3)在7℃处理1 h时,均存在一个表达高峰,MaCOR413在7℃下4 h时有一个表达高峰。这些结果表明,香蕉果实中在7℃低温胁迫下中存在CBF冷应答途径,即ICE(inducer of CBF expression)-CBF-COR(Cold-regulated genes)通路。香蕉果实CBF冷应答途径的7个基因表达均在热处理(52℃,3 min)后0.5 h迅速达到最大值,进一步研究发现,香蕉果实经热处理后于7℃低温贮藏5 d时,MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413的表达均强于对照。【结论】7℃低温胁迫下MaICE、DREB类基因、MaCOR413表达依次增强,说明低温下香蕉果实中存在CBF冷应答途径。CBF冷应答途径相关基因表达增强可能参与了热处理诱导采后香蕉果实的抗冷性。
    基于SSR标记的255个枣品种亲缘关系和群体遗传结构分析
    刘秀云,李慧,刘志国,赵锦,刘孟军
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2772-2791.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.011
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    【目的】枣原产中国,种质资源丰富。对来自中国22个省区不同用途的255个枣品种进行SSR分析,揭示这些不同产地来源的枣种质资源之间的亲缘关系和群体遗传结构,为枣种质资源的科学管理和分子标记辅助育种提供参考。【方法】利用改良CTAB提取供试枣种质的基因组DNA,以前期枣基因组测序挖掘出的SSR引物为基础,进行高效率引物筛选,并利用SSR分子标记技术对255份枣种质资源的基因组DNA进行PCR扩增,然后利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染后显色。根据条带有无统计数据,计算出多态性位点百分率(PIC),用NTSYS软件进行UPGMA聚类分析;利用Structure软件分析群体遗传结构,计算出最适群体数目,构建遗传结构图。【结果】从64对SSR引物中筛选出23对高效率SSR引物,在供试材料中共检测出117个多态性位点,各引物扩增的多态性位点数为2—10条,每对引物平均扩增多态位点数为5.09个,PIC值变幅为0.359—0.727,平均为0.548,这些多态性引物可应用到其他枣种质资源的研究中;建立了只需1—2个标记就可鉴别出来的部分枣品种的SSR指纹,可用于这些品种的快速分子鉴定;255个枣品种的聚类分析将所有枣品种分为15个亚类,包括4个大类和11个小类,不同品种间的相似系数范围0.71—1.00,其中北京花生枣单独聚为一类,与其他枣品种关系较远;‘奉节鸡蛋枣’和‘溆浦鸡蛋枣’、‘陕西奶枣’和‘天津大马牙枣’的相似系数均为1.00;结合聚类图、供试品种的用途和原产地分析,不同枣品种间的亲缘关系与品种原产地有一定相关性,但和品种用途没有显著相关性。群体结构分析中,通过绘制K与ΔK的关系图,K=15时,ΔK最大,据此将255个枣品种也同样划分为15个群体,与聚类分析结果基本一致;进一步分析表明,各群体中大部分品种血缘关系比较单一,较少品种含有其他类群的遗传成分。总体看,山西或陕西的枣品种出现在绝大部分居群中,说明这两个省的资源在不同群体间的基因交流中发挥了重要作用;南方栽培区域中来自湖南的枣品种形成了相对独立的居群,可能是其起源相对单一,且在长期栽培过程中和其他产地枣品种间基因交流较少所致。上述结果表明,供试枣品种中与来源区域相关性明显的品种由相同地域内枣品种演化而来,而另一部分与来源产地相关性不明显的品种则是由不同区域间品种经过频繁的基因交流和重组选育而来,融合了不同区域品种的特点,从而没有了明显的区域特征。【结论】不同地理环境在枣品种的群体进化中发挥了较重要的作用,影响了不同产地间枣种质资源的遗传结构组成。
    兽医
    水禽传染病专题导读:加强水禽传染病的防控技术研究和技术储备
    刘月焕
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2792-2795.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.012
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        中国是世界水禽生产和消费大国,20世纪80年代以来,水禽产业发展速度较快,饲养量平均每年以5%—8%的速度递增[1],产肉量、产蛋量和产绒量均居世界第一,是中国畜牧业的重要组成部分及农民增收的重要经济来源之一。截止2014年,中国鸭、鹅存栏量分别为6.56亿只和 2.73亿只,分别占世界鸭、鹅总存栏量的58%和 83%,占中国家禽存栏量的12%和5%[2]
        随着产业结构的调整,国内水禽业得到蓬勃发展,但同时由于集约化饲养、饲养水平参差不齐、管理经验缺乏和防疫技术滞后等原因,旧病如鸭瘟(鸭病毒性肠炎)、小鹅瘟和新发鸭坦布苏病毒病,鸭呼肠孤病毒病等疫病成为了制约产业健康发展的瓶颈。鸭瘟于1957年在中国首次报道[3],可感染鸭、鹅和其他雁形目禽类,主要造成水禽血管损伤、组织出血、消化道黏膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变,死亡率高,导致重大经济损失[4]。小鹅瘟主要感染雏鹅和雏番鸭,被感染的水禽主要表现为精神委顿、食欲废绝、下痢,有时出现神经症状,发病率和死亡率可高达100%。常引起雏鹅大批死亡,对养鹅业的发展影响极大[5]。鸭坦布苏病毒病于2010年首次在国内发现,造成产蛋鸭产蛋急剧下降,由于继发感染和饲养管理不当等因素可致死亡率达到15%—20%[6-7]。呼肠孤病毒病多发生于幼龄水禽,以肝脏和脾脏等组织出现坏死性病变为特征。2005年以来,出现了新型鸭呼肠孤病毒,病变又发生了新的变化,肝脏出现不规则块/斑块坏死和出血灶[8]
        为减少水禽疫病的危害,了解和掌握病原的生物学特性,快速和准确诊断,提供有效和经济的免疫接种用疫苗,科研人员在这些方面开展了大量的研究,并取得了一定的成果。本期(49卷14期)刊登的“水禽病研究专题”,收集有7篇论文,3篇与鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)相关,包括重组活载体疫苗的构建和胶体金快速诊断方法的建立;3篇与鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)相关,分别是鸭坦布苏病毒病卵巢病理变化规律的研究、灭活疫苗母源抗体消长规律的研究,以及1株鸡胚致弱疫苗株选育的研究;1篇是鸭呼肠孤病毒(duck reovirus,DRV)人工感染SPF鸡胚的病理学研究。虽然研究内容不尽相同,但最终目的都是为有效控制水禽传染病提供科学依据和理论基础,为通过疫苗免疫防控水禽疫病做好技术储备。
        鸭瘟(鸭病毒性肠炎),是鸭、鹅、天鹅的一种急性、热性、败血性传染病,病死率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的有效措施之一,赵丹丹等[9]研究制备的DPV-gB蛋白单克隆抗体特异、稳定,建立的DPV胶体金检测技术相比PCR、ELISA、间接免疫荧光技术、微量中和试验等检测鸭瘟的方法[10],具有速度快、无需特殊仪器设备、操作简单等优点,为基层临床检测提供了一种快速简便的方法。目前预防鸭瘟的主要措施为疫苗免疫接种。常用的疫苗有鸡胚化弱毒活疫苗和灭活疫苗,活载体疫苗因为具有活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点,而备受关注。鸭瘟病毒作为疫苗活载体的研究取得了显著的进展[11-14]。本专题中,孙莹等[15]成功构建的表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒,将GFP-gpt表达盒插入到UL2基因,通过重组病毒生物学特性的研究证明UL2基因缺失后不影响DEV的免疫原性,是一个比较稳定的外源基因插入位点,为DEV活载体疫苗研究奠定了基础。而陈柳等[16]构建了表达鹅细小病毒VP2蛋白的重组鸭瘟病毒,重组病毒细胞生长特性与亲本毒株基本一致,且重组病毒在感染细胞中能表达外源蛋白VP2,接种雏番鸭能诱导VP2特异性抗体生成,为研制小鹅瘟-鸭瘟二联活载体疫苗奠定了基础。
        鸭坦布苏病毒病自从2010年流行以来,已经成为中国养鸭业的主要疾病之一。国内多家单位和科研人员[17-23]进行了DTMUV灭活疫苗、弱毒活疫苗和载体疫苗的研究,并取得了良好的进展。鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)和活疫苗(WF100株)先后获得国家一类新兽药注册证书。本专题中于可响等[24]通过鸡胚连续传代成功获得了1株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株,为鸭坦布苏病活疫苗的研发奠定了基础。但不论是灭活疫苗、活疫苗还是基因工程疫苗,都需要建立疫苗的效力检定方法,其对疫苗质量控制至关重要。林健等[25]通过系统研究DTMUV人工感染产蛋鸭的卵巢病变产生时间、病变检查内容和判定标准,在利用卵巢病变评价疫苗的效力时,为确定疫苗效力检验何时检查卵巢病理变化和如何判定病变卵巢提供了科学依据。韩春华等[26]通过鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体效力和消长规律的研究,给出了合理的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的首免日龄。
    关于在2003年开始流行于中国的鸭呼肠孤病毒,刘晓丽等[27]利用分离的毒株建立了SPF鸡胚DRV感染模型,证明其能够在SPF鸡胚中复制增殖,并使雏鸡产生明显的病理变化,对鸡场DRV感染的防控提出了积极有效的意见。
        水禽疫病的防控形势越来越严峻,过去认为水禽抵抗力强、疫病少的观点需要改变。在注重和加强生物安全措施的同时,免疫预防是防控疫病的重要措施,有效的疫苗是关键,但目前国内水禽专用疫苗种类有限。部分病原出现变异毒株或新的血清型,致病力改变,临床症状非典型化,原有疫苗的免疫保护效果不佳。还有一些新疫病尚无商品化疫苗可用。因此,加强水禽疫病诊断、防控技术研究和技术储备,特别是利用生物学技术开发的基因工程疫苗研究,可为有效控制水禽疫病提供科学合理的理论依据和切实可行的实施方案。
    鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立
    赵丹丹,杨国平,刁有祥,陈 浩,提金凤,张 璐,张 英,李川川
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2796-2804.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.013
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    【目的】鸭瘟(DP)是由鸭瘟病毒(DPV)引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒(DPV)胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的 H6F6单抗作为标记抗体(标记的最适pH为8.0—8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释),将纯化的A8D7单抗(浓度为2倍原液稀释)和羊抗鼠IgG(浓度为10倍稀释)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:103、1:103、1:105、1:103。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。
    表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建
    孙莹,李俊平,黄小洁,李岭,曹明慧,李启红,李慧姣,杨承槐
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2805-2812.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.014
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    【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa[1]。将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF(moi=0.01),每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gptPCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196—723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为106.2TCID50/0.1mL、105.5TCID50/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1—5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15—20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以103.0TCID50/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。
    表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性
    陈柳,余斌,倪征,华炯钢,叶伟成,云涛,张存
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2813-2821.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.015
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    【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会(ICTV)的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒(DEV)作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒(GPV)主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒(DEV)疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%(4/8)。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞(CEFs)上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。
    鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育
    于可响,马秀丽,袁小远,刘存霞,胡峰,凌红丽,李玉峰,黄兵
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2822-2829.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.016
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    【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱,旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代,以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株(命名为VC2)的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐渐提高的趋势,ELD50由第20代的10-5.3/0.1mL提高到第120代的10-5.8/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】本研究通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。
    鸭坦布苏病毒病卵巢病变标准的判定
    林健,杨志远,何平有,段会娟,邹立宏,杨保收,赵际成,潘洁,王小蕾,刘立新,刘月焕
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2830-2836.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.017
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    【目的】了解产蛋鸭感染鸭坦布苏病毒后卵巢病变产生的进程和卵巢病变规律,为采用产蛋鸭卵巢病理变化检查法进行疫苗效力检验提供依据。【方法】70只260日龄产蛋樱桃谷鸭,以0.5mL/只(含100DID50)的剂量经胸部肌肉接种鸭坦布苏病毒(HB株)强毒。观察试验鸭的临床症状,统计每日产蛋数和采食量。攻毒后2 d,每只鸭经翅静脉采血,分离血清,经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚,每胚0.1mL。接种后置37℃条件下继续孵化,24 h死亡鸡胚弃去。采用RT-PCR方法测定24—72 h死亡鸡胚的DTMUV核酸,将1/5或以上鸡胚死亡且DTMUV核酸阳性的鸭判为DTMUV感染鸭。攻毒后4—10 d,每日剖杀10只鸭,观察和分析生殖系统病变。统计病变率,检查输卵管内是否有蛋,卵泡是否变形、出血和破裂,依据病变率和病变,确定检查内容和病变卵巢的判定时间和标准。【结果】(1)攻毒后3、4、5、6 d,鸭几乎不采食,产蛋数明显下降。攻毒后7 d,鸭精神状况好转;攻毒后8 d,采食量开始回升。(2)70只鸭中,除1只鸭的病毒分离结果为阴性外,其余69只鸭的病毒分离结果均为阳性,病毒分离阳性率为98.6%(69/70)。(3)攻毒后4—10 d,共64只产蛋期鸭的生殖器官可以判定。(4)攻毒后4、5、6、7、8、9和10 d,卵巢病变率分别为66.7%(6/9)、100%(10/10)、100%(10/10)、100%(9/9)、100%(9/9)、100%(9/9)和100%(8/8)。(5)除攻毒后4 d有2只鸭输卵管中有蛋外,其余62只鸭输卵管中均无蛋,无蛋率为96.9%(62/64)。(6)攻毒后4—10 d,96.9%(62/64)鸭的卵泡变形,96.9%(62/64)鸭的卵泡出血,95.3%(61/64)鸭的卵泡变形和出血,34.4%(22/64)卵泡破裂。【结论】(1)确定卵巢病理变化检查时间为攻毒后7—8 d;(2)具有变形或出血病变之一,判病变卵泡。输卵管内无蛋且有3个及以上病变卵泡,判为病变卵巢。
    鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)母源抗体的消长规律
    韩春华,赵际成,段会娟,林健,杨志远,谢佳,潘洁,王小蕾,刘立新,刘月焕
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2837-2843.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.018
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    【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力,制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)二免后135日樱桃谷种鸭的种蛋孵化,随机取5、7、10和15日龄免疫种鸭后裔雏鸭10只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭5只,采血,分离血清,测定母源抗体,并以0.1mL/羽(含100DID50)的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现(采食量、粪便、精神和死亡情况),观察至攻毒后10d。攻毒后2d经颈静脉采血,分离血清进行病毒分离。每份血清接种5枚6日龄SPF鸡胚,0.1mL/枚,37℃孵化,24h以内死亡鸡胚视为非特异死亡,孵化至168h。只要有1枚及以上鸡胚死亡则判该鸭感染。计算母源抗体雏鸭组的攻毒保护率和无母源抗体组的发病率。攻毒后5d,分别称量雏鸭的体重,计算平均日增重。对成对样本进行T检验,分析母源抗体对雏鸭增重的影响。通过试验鸭中和抗体、增重变化和病毒分离的方法评价母源抗体的效力。【结果】(1)1日龄雏鸭的母源抗体阳性率最高,1、5、7、10和15日龄雏鸭的母源抗体阳性率分别为56.1%(37/66)、40%(4/10)、50%(5/10)、30%(3/10)和0%(0/10),5—7日龄抗体阳性率处于平台期,15日龄时母源抗体降低至全阴性;(2)攻毒后对照鸭表现精神沉郁(20/20)、仰翻和侧翻等神经症状(6/20)及死亡(2/20),有母源抗体的雏鸭临床症状明显轻于对照组。(3)5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。(4)5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭的攻毒保护率分别为50%(5/10)、60%(6/10)、20%(2/10)和0%(0/10); 5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭的发病率均为100%。(5)5和7日龄雏鸭平均增重和攻毒保护率最高,分别为50%(5/10)和60%(6/10),10和15日龄雏鸭的母源抗体尽管低(20%和0%)或阴性,仍然有明显的保护作用。【结论】(1)鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体能够保护10日龄内雏鸭;(2)疫苗首次免疫的时间以7—10日龄为最佳。
    鸭呼肠孤病毒人工感染SPF鸡胚的病理学研究
    刘晓丽,刘婷,刘波,程国富,谷长勤,张万坡,胡薛英
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2844-2849.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.019
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    【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播, 禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒HP080421株为研究对象,该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征,病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。研究了鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性,通过雏鸡的病理变化特点,探讨所分离的HP080421鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群,旨在为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的HP080421株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种SPF鸡胚,建立SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,培养鸡胚至雏鸡出壳,运用临床观察、病理剖检、H.E染色和免疫组织化学染色等病理组织学检查方法,对鸭呼肠孤病毒感染SPF鸡胚进行病理学研究和致病性分析。【结果】研究发现病毒感染鸡胚孵化培养至22—23日龄均啄壳,但不能自主出壳,需人工剥壳。病理剖检可见雏鸡的肝脏、脾脏肿胀质脆,表面及实质分布有黄白色坏死灶;脑部组织肿胀,并可见出血点和出血斑。H.E染色的组织病理学观察可见接毒组雏鸡肝脏、脾脏的坏死灶周围有大量淋巴细胞浸润;法氏囊的滤泡髓质部和胸腺的髓质部淋巴细胞减少、缺失;脑、肺脏、肾脏存在不同程度的淤血、出血和水肿;免疫组织化学染色结果表明:病毒阳性信号主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊等器官,并且位于上皮细胞和巨噬细胞的细胞质和胞核内。【结论】鸭呼肠孤病毒株HP080421 能够在SPF鸡胚中复制增殖,并使雏鸡主要器官发生明显的病理变化,病理变化主要集中在肝脏和淋巴器官,因此鸭呼肠孤病毒可通过垂直传播感染鸡群,还可导致雏鸡免疫抑制。本研究通过SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,阐述了鸭呼肠孤病毒感染鸡群的可能性,因此在实际养殖过程中,养殖户要防止鸭呼肠孤病毒对鸡胚的污染,切断传播途径,以达到预防鸡群感染鸭呼肠孤病毒的目的。
    研究简报
    不同番茄品种对番茄黄化曲叶病毒的抗病性分析
    田兆丰,刘伟成,厚凌宇,谢华,罗晨,柴敏
    中国农业科学. 2016, 49(14):  2850-2856.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.020
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    【目的】番茄黄化曲叶病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV) 是一种影响全世界番茄生产的病害,培育抗病品种是最有效、经济和持久的防控手段。目前生产上应用的抗病品种繁多,但存在对TYLVC不同抗性基因的抗性水平研究甚少、了解不够全面的问题。为了解带有不同抗性基因的番茄品种对番茄黄化曲叶病毒病的抗性,对北京市农林科学院蔬菜中心培育的番茄品种抗病性进行检测,并利用半定量RT-PCR方法分析抗病基因和抗病蛋白的表达水平。【方法】选取携带有Ty3a/Ty3a的番茄材料秋光285(Ty3a 纯合)、棚137×246(Ty3a 杂合),携带Ty1+Ty3a纯合的秋光120、携带Ty1+Ty3a杂合的秋光81和感病对照M82为试验材料,观察番茄植株自然条件下发病情况。通过调查发病率和病情指数,考查这些番茄品种的抗病性,并利用RT-PCR方法分析抗病基因Ty1Ty3a以及病程相关蛋白葡聚糖酶和几丁质酶基因的表达水平。【结果】携带抗性基因的杂合体、纯合体抗病性差异不明显,含有两个抗性基因和含有单一抗病基因品种的抗病性稍有差异,但差异不显著。半定量RT-PCR结果显示不同番茄品种在感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随着发病时间的增加,Ty-3aTy-1的表达量逐渐增强。Ty-3a在4个番茄品种中表达水平由弱到强依次为秋光285(Ty-3a纯合)、棚137×246(Ty-3a杂合)、秋光120(Ty-1+Ty-3a纯合)和秋光81(Ty-1+Ty-3a杂合),Ty-1在秋光81中的表达显著高于在秋光120中的表达。同时,植株体内葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比对照显著增加,并随着发病时间的增加逐渐增强。在发病20 d和30 d后,携带Ty-1+Ty-3a杂合的秋光81的葡聚糖酶基因表达显著强于其他几个品种。【结论】几个番茄材料对TYLCV的抗性由弱到强依次为秋光285(Ty3a 纯合)、棚137×246(Ty3a杂合)、秋光120(Ty1+Ty3a纯合)和秋光81(Ty1+Ty3a杂合)。不同番茄抗病品种感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随发病时间增加而增强,葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比感病对照显著增加,表明番茄抗病品种在感染TYLCV后的抗病性除了与抗性基因的表达有关外,同时也与抗病相关蛋白表达增强有关。