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当期目录

    2016年 第49卷 第10期 刊出日期:2016-05-16
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    水稻穗退化突变体spd11的遗传分析及候选基因鉴定
    钟萍,陈璞睿,王迁,肖富良,张宽,马芙蓉,黄美菱,王平荣,邓晓建,孙昌辉
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1835-1843.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.001
    摘要 ( 426 )   HTML ( 1 )   PDF (4612KB) ( 526 )   收藏
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    【目的】对水稻穗退化突变体spd11进行遗传分析及候选基因鉴定,以便了解水稻穗发育的调控机制。【方法】用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理粳稻品种中花11的直立密穗突变体dep2,从突变体库中筛选到一份穗退化突变体spd11。观察该突变体表型,并调查其主要农艺性状。由于突变体不能结实,将可分离出spd11突变植株的株系分单株收种、种植,并对后代株系的分离情况进行调查统计,分析该突变性状的遗传行为。将spd11杂合植株与冈46B杂交的F2后代作为定位群体,对spd11突变体进行基因定位,遴选候选基因并进行DNA测序验证;同时,对不同物种中spd11候选基因的同源基因所编码蛋白进行进化树和序列比对分析。【结果】与其对照亲本相比,spd11植株剑叶长度增加23%;穗部一次枝梗明显缩短,且一次枝梗数量减少58%。小穗几乎完全退化为白色絮状物,偶尔可见个别退化不完全的颖花着生,且该颖花仅由一个完全闭合的颖壳组成,不能正常结实。除此以外,spd11的分蘖数及剑叶宽等农艺性状无显著差异。遗传分析表明,在可分离出spd11突变株的后代中,一部分株系无分离,全部植株均为正常株,而另一部分株系有突变株分离,并且正常植株与突变植株分离明显,分离比例经卡方(χ2)测验符合3﹕1,表明spd11的突变性状由一对隐性核基因控制。利用分子标记将该突变基因定位于第1染色体长臂2个In/Del标记ch1-2295和ch1-2299之间约43.2 kb的区域内,遗传距离分别为0.23 cM和0.46 cM,该区间内共有8个预测基因。测序分析发现,spd11突变体中OsLOG编码区第116位碱基G突变为碱基A,造成编码蛋白的第39位半胱氨酸(C)突变为酪氨酸(Y)。同源蛋白比对和系统进化分析表明LOG蛋白在不同物种中都是高度保守的,并且spd11的突变发生在非常保守的氨基酸上。对已报道的多个log等位突变体的突变位点和突变表型严重程度的比对分析表明,spd11突变位点可能处于OsLOG蛋白功能的关键位点。【结论】SPD11可能是细胞分裂素激活酶基因OsLOG的等位基因,spd11在OsLOG外显子上一个关键位点发生了突变,导致OSLOG蛋白功能受损,使细胞分裂素的活化进程受阻,从而产生了穗退化的突变表型。
    芝麻AQP家族的全基因组序列鉴定及其特征分析
    吴向阳,程朝泽,吕高强,王心宇
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1844-1858.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.002
    摘要 ( 282 )   HTML ( 2 )   PDF (1766KB) ( 579 )   收藏
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    【目的】从芝麻全基因组中分离鉴定水通道蛋白AQP(aquaporin)家族基因,并进行系统进化关系、连锁群定位、基因结构、跨膜结构域和亚细胞定位预测、保守性氨基酸残基以及青枯雷尔氏菌诱导表达分析,为芝麻AQP的功能研究与利用奠定基础。【方法】通过生物信息学手段,结合芝麻基因组注释信息,鉴定芝麻AQP家族成员序列信息,并用InterPro逐一进行验证。利用ClustalW2对芝麻、拟南芥和水稻的AQP以及马铃薯的XIPs进行多序列比对,用MEGA6.0构建进化树。通过MapInspect和Gene Structure Display Server 2.0进行连锁群定位和基因结构分析。采用ProtParam、WoLF PSORT和TMHMM Server v.2.0在线工具预测芝麻水通道蛋白的分子质量和等电点、亚细胞定位及跨膜结构域。通过芝麻、拟南芥和水稻AQP及马铃薯XIPs的蛋白多序列比对结果推测NPA基序、ar/R滤器及P1—P5的氨基酸残基。利用前期研究获得的转录组测序结果进行青枯雷尔氏菌诱导表达分析,并通过qRT-PCR技术对差异表达较为明显的12个芝麻AQP进行验证。【结果】系统分析鉴定了36个芝麻AQP家族基因,根据多序列比对及系统进化分析将其分为5个亚家族:13个质膜内在蛋白(PIP)、12个液胞膜内在蛋白(TIP)、8个类NOD26膜内在蛋白(NIP)、2个膜内在小分子碱性蛋白(SIP)和1个未知内在蛋白(XIP),其中有34个基因定位在12个连锁群上。同一亚家族成员在基因结构、蛋白序列、亚细胞定位预测及保守性氨基酸残基等方面都较为相似。青枯雷尔氏菌诱导表达分析显示,NIPs、SIPs和XIPs表达无明显变化,部分PIPs和TIPs能够响应青枯菌诱导。SiPIP1;2、SiPIP1;3、SiPIP2;3和SiPIP2;4受青枯菌诱导后表达上调,SiPIP1;3和SiPIP2;3为持续上调,而SiPIP1;2和SiPIP2;4的表达先下调后上调;与之相反,表达下调较为显著的有SiPIP1;4、SiPIP2;1、SiPIP2;6、SiTIP1;1、SiTIP1;3、SiTIP2;1及SiTIP2;2。上述差异表达基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。【结论】通过全基因组分析,在芝麻中鉴定出36个AQP家族基因,分为5个亚家族,分布于12个连锁群上,大部分基因具有1—4个内含子(除SiNIP1;2有7个内含子外)。根据ar/R滤器和P1—P5氨基酸残基组成类型,预测不同亚家族AQP可能识别的底物。青枯菌诱导表达分析表明,部分PIPs和TIPs成员的表达发生了显著变化。
    耕作栽培·生理生化
    全球气候变暖对中国种植制度可能影响Ⅻ. 气候变暖对黑龙江寒地水稻安全种植区域和冷害风险的影响
    王晓煜,杨晓光,吕 硕,陈 阜
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1859-1871.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.003
    摘要 ( 231 )   HTML ( 1 )   PDF (2148KB) ( 483 )   收藏
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    【目的】以1981年为时间节点,将1961—2010年划分为2个时段,结合未来不同升温情景,定量分析历史和未来气候变暖对黑龙江寒地水稻安全种植区域影响以及由此带来的冷害风险。【方法】利用积温带划分标准和农业气候指标,结合ArcGIS方法,对比分析历史和未来黑龙江积温带及寒地水稻安全种植区界限的空间变化特征。基于气象行业标准中水稻冷害标准分析寒地水稻安全种植北界变化敏感区域的延迟型冷害及障碍型冷害变化特征,评估气候变暖背景下水稻种植北界敏感地区冷害风险特征,并预估未来不同升温情景下冷害风险演变趋势。【结果】与1961—1980年相比,研究区域内1981—2010年积温带发生了明显的北移东扩,平均北移1.19个纬度,位移最大的是第五积温带和第六积温带,面积增加最多的是第二积温带,几乎覆盖了整个松嫩平原。未来不同升温情景下各积温带北扩趋势明显,面积增加最多的是第一积温带。1981—2010年寒地水稻安全种植北界相对于1961—1980年北移121 km,水稻安全种植北界北移至嫩江中部-五大连池-逊克北部一线。未来升温1—3℃情景下,寒地水稻安全种植北界向北移动410.5—545 km,向北扩展至黑龙江省呼玛以北地区,温度升高3℃时,除漠河地区外都可种植寒地水稻。比较寒地水稻种植界限敏感区域和非敏感区冷害风险可见,敏感区域冷害风险明显高于非敏感区域,其中障碍型冷害风险高于延迟型冷害,寒地水稻种植区严重冷害出现频率最高,其次是轻度冷害,中度冷害最低。1981—2010年敏感区域严重和轻度延迟型冷害较非敏感区域显著增加,中度延迟型冷害风险在敏感区域和非敏感区域均较低,敏感区域的各级障碍型冷害较非敏感区域明显增加;未来升温情景下敏感区域的各级冷害均高于非敏感区域。【结论】气候变暖背景下黑龙江积温带及寒地水稻安全种植北界发生了明显北移,未来升温情景下仍呈北移趋势。寒地水稻种植敏感区域的冷害风险明显高于非敏感区域,随着未来温度升高,冷害有不同程度的减轻,但仍需进一步关注寒地水稻种植区北缘北扩后的冷害风险,采取改进栽培技术与选育抗寒早熟品种等低温冷害防御措施,同时避免水稻种植区域的盲目扩大和品种越区种植,加强冷害防御能力。
    不同地力下基蘖肥运筹比例对水稻产量及氮肥吸收利用的影响
    范立慧,徐珊珊,侯朋福,薛利红,李刚华,丁艳锋,杨林章
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1872-1884.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.004
    摘要 ( 386 )   HTML ( 1 )   PDF (477KB) ( 444 )   收藏
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    【目的】研究不同地力条件下,水稻基蘖肥运筹比例对水稻产量、氮素利用率及群体质量的影响,并探明水稻高产适宜的基蘖肥运筹比例以及其是否受土壤地力条件的影响。【方法】选用武运粳23号为供试品种,采用大田小区试验,考察了5种基蘖肥运筹比例R1(10﹕0)、R2(7﹕3)、R3(5﹕5)、R4(3﹕7)、R5(0﹕10)在2种地力水平(高地力、低地力)下对水稻产量及产量构成因素、氮素吸收利用及转运和群体质量的影响。【结果】低地力土壤下,随着蘖肥比例的增加,分蘖速度先增加后减少,高峰苗数降低,干物质积累、氮素利用率及产量均呈现先增加后减少的趋势,基蘖肥比例在施氮量300 kg·hm-2时以3﹕7最佳,施氮量240 kg·hm-2时以5﹕5最佳,此时产量及氮素农学利用率分别可达13.12、13.16 t·hm-2及27.00、29.28 kg·kg-1,显著高于其他处理。在高地力土壤中,随着蘖肥比例的增加,穗数先增加后减少,穗粒数呈现增加的趋势,产量、氮素农学利用率及偏生产力呈现减少趋势,但处理间差异不显著。高地力条件下的分蘖发生速率大于低地力条件,达到高峰苗时间缩短,高峰苗数高于低地力条件。高地力条件下抽穗期至成熟期的干物质积累量较高,有利于后期向籽粒中转运光合产物,因此结实率和千粒重要高于低地力条件,从而导致高地力条件下产量整体高于低地力。在2种地力条件下,不施基肥(R5)处理的分蘖数及高峰苗数最低,分蘖发生时间推迟,表明基肥对于水稻实现分蘖快发、早发具有一定的促进作用;随着基肥用量的增加,分蘖发生时间缩短,缓苗加快,但是蘖肥期氮素供应不足,分蘖速率降低,使得群体到达有效穗数的时间延长。合理协调基肥和蘖肥的比例,低地力条件下基肥用量以50—60 kg·hm-2、基蘖肥比例为1﹕1时,可保证高产的同时减少总氮肥用量(从300 kg·hm-2 降低到240 kg·hm-2)。【结论】基蘖肥运筹比例对产量及氮素利用率的影响因地力水平的差异而不同,并受总施氮量的影响。在低地力下要保证高产并减少氮肥用量,必须注重基蘖肥的合理运筹,保证一定量的基肥投入,并调整好基蘖肥比例。
    植物保护
    链格孢菌苹果致病型的ATMT转化体系的建立
    顾雪迎,施文骁,王洪凯,郭庆元
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1885-1891.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.005
    摘要 ( 241 )   HTML ( 1 )   PDF (1043KB) ( 252 )   收藏
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    【目的】链格孢菌(Alternaria alternate)苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液(含105孢子)涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36—48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,107个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。
    避雨栽培对葡萄霜霉病菌孢子囊飞散时空动态的影响
    于舒怡,刘长远,王 辉,刘 丽,关天舒
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1892-1902.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.006
    摘要 ( 211 )   HTML ( 1 )   PDF (515KB) ( 340 )   收藏
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    【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上最重要的病害之一,在多雨潮湿地区常造成严重的产量损失。研究旨在明确避雨栽培对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)孢子囊飞散的影响,确定孢子囊飞散与病情变化之间关系,揭示避雨栽培对病菌数量的控制作用,推测避雨栽培下霜霉病的初侵染来源,为葡萄霜霉病的科学防控提供理论依据。【方法】2013年生长季7—9月份,分别对沈阳地区露地和避雨栽培小区内葡萄霜霉病发病情况进行定株定枝系统调查,统计得到病叶率和病情指数。应用SPSS19.0中回归曲线估计程序构建葡萄霜霉病流行时间动态模型,获得能描述不同栽培模式下葡萄霜霉病发病动态的模型参数,并推导2种栽培模式下霜霉病流行时期和流行速率。通过对田间小区内的孢子囊飞散进行定期监测,对比不同栽培模式下孢子囊飞散时间动态差异,探索关键流行时期内病害流行速率与捕孢量之间的关系。对比分析避雨栽培对葡萄霜霉病孢子囊水平、垂直方向飞散的影响,明确关键流行时期内孢子囊的主要来源和孢子囊飞散的主要影响因素。【结果】避雨和露地栽培下葡萄霜霉病的季节流行曲线趋势一致,均表现为典型的S形曲线。应用SPSS19.0软件分析,明确了Logistic模型能够反映沈阳地区葡萄霜霉病流行时间动态情况。露地和避雨栽培下病害流行时期:指数增长期分别为7月5—23日和8月18—30日,逻辑斯蒂增长期分别为7月23日至8月19日和8月30日至9月17日,衰退期分别为8月19日至葡萄生育末期和9月17日至葡萄生育末期。露地栽培下整个生长季孢子囊飞散表现为多峰曲线,当日降雨对孢子囊飞散有显著的冲刷作用。沈阳地区露地和避雨栽培下孢子囊飞散盛期分别为7—8月和8—9月。避雨栽培可明显降低空中孢子囊数量,从而减少孢子囊与避雨设施内葡萄叶片的接触概率,达到降低菌源基数的作用。避雨设施边行最早捕获孢子囊,且数量最多,随着逐渐向中心靠近,首次捕孢时间逐渐推迟,数量逐渐降低。葡萄叶幕对于孢子囊水平方向的飞散具有显著的阻隔效应。不同栽培模式下均以接近地面处的捕孢量最大,且随着高度增加,捕孢量逐渐减少。避雨设施对于接近棚顶处的孢子囊飞散有着显著的遮蔽作用。【结论】避雨栽培可推迟葡萄霜霉病始发时间和首次捕孢时间,缩短病害流行过程和孢子囊飞散周期,显著降低病害流行程度和孢子囊飞散数量。孢子囊飞散受到葡萄叶幕和避雨设施显著的阻隔效应。避雨栽培下葡萄霜霉病的初侵染主要为本地露地栽培下葡萄霜霉病病株上的病斑产生的孢子囊。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    长期施肥对黄壤性水稻土磷平衡及农学阈值的影响
    刘彦伶,李渝,张雅蓉,张文安,蒋太明
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1903-1912.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.007
    摘要 ( 219 )   HTML ( 1 )   PDF (451KB) ( 424 )   收藏
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    【目的】研究长期施肥条件下土壤有效磷(Olsen-P)的演变特征及土壤磷素的累积状况,分析土壤磷素累积与土壤有效磷的响应关系,明确Olsen-P的农学阈值及合理磷肥施用量,为西南黄壤地区科学施用磷肥提供理论依据。【方法】以贵州黄壤肥力与肥料长期定位试验为平台,选择试验中6个处理分别是不施肥(CK)、偏施氮钾肥(NK)、常量氮磷钾肥(NPK)、常量有机肥(M)、减1/2有机肥+减1/2氮磷钾肥(1/2 M +1/2 NPK)和常量有机肥+常量氮磷钾肥(MNPK)。分析西南黄壤性水稻土19年(1995—2013)土壤Olsen-P含量与植株吸磷量,研究土壤Olsen-P的变化规律及土壤累积磷盈亏状况,通过Mitscherlich方程模拟作物相对产量对土壤Olsen-P的响应关系,明确西南黄壤性水稻土的农学阈值,并分析Olsen-P与施肥量之间的关系。【结果】长期施用磷肥处理可显著提高土壤Olsen-P含量,各施磷处理Olsen-P年增长速率在0.72—2.47 mg·kg-1·a-1,其中MNPK处理Olsen-P增长速率最大,NPK处理最小,主要与施肥量的高低有关;有机肥配施化学磷肥比单施化学磷肥和单施有机肥更能有效地促进作物对磷素的吸收;不施磷处理土壤磷素一直处于亏缺状态,施磷处理土壤磷素盈余量为176—1 200 kg·hm-2,其中MNPK处理磷素盈余量最高;土壤累积磷盈余量与土壤Olsen-P增量呈显著线性相关,土壤中磷素每盈余100 kg·hm-2,NPK、M、1/2M+1/2NPK、MNPK处理Olsen-P含量分别提高4.0、2.0、3.2和2.0 mg·kg-1;土壤每年磷盈亏和Olsen-P含量与磷肥施用量呈极显著正相关关系,磷肥用量(纯P)17.4 kg·hm-2时土壤磷盈亏呈持平状态,西南黄壤性水稻土Olsen-P的农学阈值为15.8 mg·kg-1;对应的施肥量(纯P)为每年37.2 kg·hm-2·a-1。【结论】土壤有效磷随土壤磷素盈余而变化,同时与磷素投入量密切相关,当磷肥用量(纯P)为17.4 kg·hm-2·a-1土壤磷素呈持平状态。当磷肥用量(纯P)为37.2 kg·hm-2·a-1时,可获得较高作物产量,磷肥当季利用率高,且磷素在土壤中累积较少。当磷肥用量(纯P)大于37.2 kg·hm-2·a-1时,作物产量对磷肥用量无响应,大量磷素累积在土壤中,增加土壤磷素的流失风险。土壤中累积磷盈余量一定的情况下,西南黄壤性水稻土长期单施化学磷肥提升土壤Olsen-P的速率大于施用有机肥处理。
    长期玉米连作下黑土各组分有机质化学结构特征
    张福韬,乔云发,苗淑杰,韩晓增
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1913-1924.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.008
    摘要 ( 279 )   HTML ( 1 )   PDF (633KB) ( 451 )   收藏
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    【目的】研究玉米连作24年前后黑土有机质红外光谱特征,探明长期玉米连作对黑土各团聚体及密度组分中有机质结构的影响,完善长期连作下土壤有机质化学结构动态变化理论。【方法】以中国科学院海伦农业生态试验站长期定位试验为研究平台,选取24年玉米连作下耕层(0—20 cm)土壤为研究对象,以试验设置前土样为对照,根据团聚体和密度大小,将土壤有机质进行分级,分别用元素分析仪和傅里叶红外光谱仪测定原土、各粒级团聚体及密度组分中的碳含量和有机质的红外光谱,对比分析玉米连作24年前后土壤有机质含量及红外光谱特征。【结果】玉米连作24年后,全土中碳含量降低5.3%,2—0.25 mm团聚体中碳含量显著降低,其他粒级团聚体中有降低的趋势;LF(游离态轻组)中碳含量增加32.74%,OF(闭蓄态轻组)中减少16.72%,MF(矿质结合态组分)中没有显著变化。土壤有机质中脂肪族-CH、多糖C-O、酚醇-OH吸收峰相对强度增强,芳香族C=C和羧基C=O吸收峰相对强度降低,脂肪族-CH/芳香族C=C比值增加。在各粒级团聚体中,-CH/C=C比值增加主要表现在>2 mm团聚体中,主成分分析也表明>2 mm团聚体中有机质结构变化最大,该粒级团聚体中3个密度组分LF、OF和MF有机质-CH/C=C比值增加,且LF中增加程度最大;在其他粒级中的3个密度组分有机质-CH/C=C比值有增加的趋势。【结论】长期玉米连作,黑土大粒级团聚体和各密度组分中有机质结构趋于脂肪化、简单化,团聚体和矿物质结合对有机质的保护作用降低,黑土有机质稳定性下降。
    基于可见/近红外光谱的黄河口区土壤盐分及其主要离子的定量分析
    刘亚秋,陈红艳,王瑞燕,常春艳,陈哲
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1925-1935.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.009
    摘要 ( 228 )   HTML ( 1 )   PDF (579KB) ( 349 )   收藏
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    【目的】定量、准确地监测盐渍土,对其防治和农业可持续发展至关重要,论文旨在明确黄河口区土壤盐分及其主要离子的特征光谱,建立适用于该区域的土壤盐渍化定量分析模型,提高其定量分析的精度和稳定性。【方法】首先以山东省垦利县为研究区,于2014年10月 5—9日野外采集代表性土样96个,对土样风干后,采用土壤化学分析方法室内分析盐分及其主要离子(Cl-、Na+、Ca2+)含量,并采用美国ASD Fieldspec 3光谱仪测定土样可见/近红外高光谱数据,对光谱反射率进行去噪、一阶导数变换等预处理;然后基于盐分及其主要离子不同含量的样本光谱分析盐分及其主要离子的光谱响应,在此基础上,对样本的土壤盐分及其主要离子含量与反射率的一阶导数光谱进行逐波段的相关分析,按照相关系数高且显著的原则,选取各自的敏感波段,再根据敏感波段的交叉情况选取集中波段为特征波段,进而选取特征波段中具有极值相关系数的波段作为显著特征波段,综合确定表征土壤盐分及其主要离子(Cl-、Na+、Ca2+)的特征光谱;最后分别采用多元线性回归(multiple linear regression,MLR)、支持向量机(support vector machine,SVM)和随机森林(random forest,RF)方法构建土壤盐分及其主要离子的定量高光谱分析模型。【结果】研究区土壤盐分及其主要离子(Cl-、Na+、Ca2+)含量的光谱曲线形状和走势整体一致;土壤盐分及其主要离子(Cl-、Na+、Ca2+)的光谱响应谱区为1 320—1 495、1 790—1 920、2 120—2 290 nm;基于相关分析的土壤盐分及其主要离子的敏感谱区为1 490—1 520、1 890—1 930 nm;最后综合光谱响应及相关分析确定土壤盐分及其主要离子的特征波段为1 493、1 801、1 911和2 289 nm,显著特征波段为1 493和1 911 nm。模型结果显示基于2个显著特征波段反射率一阶导数的模型精度均与4个特征波段的模型精度相当,表明显著特征光谱作为盐分及其主要离子的特征光谱进行其定量分析的有效性。比较3种建模方法,RF模型的预测效果最好,SVM模型次之,而MLR模型精度最低;对于盐分、Cl-和Na+,3种方法构建的模型均可有效地用于其定量分析,精度较高且稳定,然而Ca2+预测精度还有待提高。通过综合比较分析,基于显著特征波段(1 493和1 911 nm)反射率一阶导数构建的随机森林(RF)模型对盐分、Cl-和Na+均具有较好的估测精度和稳定性,也可用于Ca2+的定量估测。【结论】基于光谱响应及相关分析综合确定盐分及其主要离子的显著特征光谱(1 493和1 911 nm反射率一阶导数),进而采用随机森林方法构建盐分及其主要离子的定量估测模型,适用于黄河口区土壤盐渍化信息的有效提取。
     
    园艺
    三种类型柑橘成熟果实表面蜡质分析
    王金秋,何义仲,徐坤洋,罗 怿,盛 玲,罗 焘,刘 欢,程运江
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1936-1945.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.010
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    【目的】分析中国主栽柑橘类型(‘鄂柑一号’椪柑(Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan)、尤力克柠檬(C. limon cv Eureka cv. Lemon)和沙田柚(C. grandis Osbeck cv. Shatian Yu)成熟期果实表面蜡质,建立中国柑橘果实蜡质基础数据,为科学指导柑橘采后生产提供依据。【方法】以3种类型柑橘的成熟果实为材料,采用扫描电镜观察果实表面蜡质晶体结构;用GC-MS测定果实表面蜡质成分及含量;用定量PCR检测蜡质相关基因在不同类型柑橘果皮表达特性。【结果】扫描电镜结果显示沙田柚蜡质晶体呈较大的倒伏片状,椪柑片状晶体较小,柠檬介于上述两者之间。GC-MS分析表明,3种类型柑橘果实表面外蜡中脂肪族物质主要组成成分相同,分别为:脂肪醛、饱和游离脂肪酸、饱和正链烷烃和伯醇,但品种之间各组分比例及碳原子分布有一定差异。椪柑、柠檬以及沙田柚外蜡含量分别为1.1、2.2和9.3 μg·cm-2。椪柑外蜡中醛、脂肪酸、烷烃和伯醇所占比例为50%、16%、28%和6%;柠檬中各个成分比例分别为42%、30%、18%和11%;沙田柚中则分别为50%、31%、12%和7%。椪柑中26醛和28醛含量最高;柠檬中碳原子数分配比较均匀,没有绝对占主导的成分;沙田柚脂肪族物质中高碳原子数所占比例比其他柑橘类型果实蜡质中高,尤其是32酸、31和33烷烃含量很高。椪柑和柠檬总蜡含量分别为4.3和4.6 μg·cm-2。椪柑总蜡中醛、脂肪酸、烷烃和伯醇与外蜡各成分所占比例相似,分别为57%、14%、23%和4%;柠檬总蜡各成分所占比例则分别为53%、15%、19%和8%。总蜡不同种类脂肪族物质碳原子数分配与外蜡基本相同。萜类物质种类和含量在不同品种类型之间存在较大差异:柠檬中主要的三萜类成分是软木三帖酮(friedelin)、羽扇豆醇(lupeol)、α-香树精(α-amyrin)和β-香树精(β-amyrin);椪柑中主要含有后3种,没有检测到软木三帖酮;角鲨烯和法尼醇为紧皮柑橘(柚和柠檬)特有。定量表达分析表明,超长链脂肪酸辅酶A合成酶KCS6在不同柑橘类型之间的表达趋势与其对应的物质含量比较吻合,推测该基因造成了这些柑橘类型蜡质含量的差异。酰基转移酶CER2在沙田柚中表达量最高,推测该基因则导致了沙田柚中大于30碳原子数的蜡质成分在不同柑橘类型中占据最高比例。3种类型柑橘果实表面总蜡和外蜡中脂肪族物质均以醛为主,烷烃或酸次之,伯醇最少。总蜡和外蜡物质分配存在差异,其中伯醇和超长链脂肪酸在外蜡中占据比例更高,烷烃则是在外蜡中占据比例较低。萜类物质中三萜类和淄醇仅在总蜡中可以测定出,而角鲨烯和法尼醇则在外蜡和总蜡中都含有。【结论】蜡质成分在柑橘果实中受遗传背景和果皮结构共同影响。宽皮柑橘与紧皮柑橘具有不同的蜡质特征,本研究结果对宽皮柑橘和紧皮柑橘品种特异性的果蜡配方研发具有重要参考价值。
    草莓果实不同发育时期的蛋白磷酸化水平
    吕晓苏,李宇轩,苗 英,陈良珂,沈元月,秦 岭,邢 宇
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1946-1959.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.011
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    【目的】通过分析草莓果实生长发育过程中蛋白磷酸化水平的变化以期揭示蛋白磷酸化在果实生长发育成熟衰老过程中的作用。【方法】以iTraq(isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白质组学结合LC-MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)的方法对草莓果实的5个不同发育时期(小绿果时期、大绿果时期、白果时期、果实成熟期、果实成熟后期)的蛋白磷酸化水平进行综合分析,并对这些鉴定到的磷酸化蛋白进行生物过程分类、亚细胞定位分类和分子功能分类。通过综合分析多个数据库的比对结果,对所鉴定的磷酸化蛋白进行功能的预测。【结果】不同发育时期的磷酸化蛋白有所差异,并且在大绿果时期到果实成熟期磷酸化差异蛋白总数比其他时期显著增加,其中,多数的磷酸化蛋白参与生长发育调控。生物过程分类结果显示,这些磷酸化蛋白多数集中在植物信号转导途径和糖代谢途径中,其中,参与信号转导途径的有17个,参与糖代谢生物过程的有8个。属于MAPK级联途径的有MAPKKK家族的101308592、MAPK家族的470122684和596127083。596127083的磷酸化水平在各个发育时期较为稳定,101308592随发育时期磷酸化水平逐渐升高,而470122684的磷酸化水平从软果期开始急剧下降。亚细胞定位分类结果显示,多数磷酸化蛋白定位在细胞核和细胞质中。分子功能分类结果显示,多数磷酸化蛋白具有转录调节和磷酸化去磷酸化的分子功能,鉴定出与生长发育调节相关的磷酸化蛋白有24个。其中,具有转录调控功能的有4个,参与细胞分裂的有6个,还有一部分磷酸化蛋白与调控生长发育的激素的响应有关,除此之外,还鉴定到3个与果实的成熟软化相关的磷酸化蛋白。另外,一部分蛋白有多种磷酸化修饰方式,其中,SNF1相关蛋白激酶β亚基有3种磷酸化修饰,且其磷酸化水平各不相同。【结论】同种蛋白可能同时存在不止一种磷酸化修饰方式。不同的磷酸化修饰方式的作用不尽相同。不同的时期占主导地位的修饰方式也不尽相同。磷酸化蛋白不仅参与转录调节和细胞分裂分化,还参与果实发育过程中对植物激素的响应和糖的代谢积累,甚至参与果实成熟软化的调节。另外,101308592和470122684可能参与果实生长发育的调控。总之,蛋白磷酸化修饰在草莓果实生长发育过程中起重要的调控作用。
    贮藏·保鲜·加工
    添加不饱和脂肪酸对酿酒酵母胞内脂肪酸成分和葡萄酒香气的影响
    段亮亮,潘秋红,王亚钦,叶冬青,段长青,燕国梁
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1960-1978.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.012
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    【目的】研究葡萄汁中不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acids,UFAs,包括油酸、亚油酸和α-亚麻酸)含量同时变化对葡萄酒发酵过程中酿酒酵母胞内脂肪酸成分和酿酒香气的影响,为提高葡萄酒品质提供参考。【方法】选用‘美乐’葡萄(Vitis vinifera L.)汁为培养基,试验设置对照组(不添加UFAs,CK)、低浓度UFAs添加组(LFG)和高浓度UFAs添加组(HFG),比较葡萄酒酒精发酵过程中3个处理组间酵母(Saccharomyces cerevisiae EC1118)生长(OD600)、细胞内脂肪酸成分以及酿酒香气成分的差异。【结果】提高UFAs浓度能够促进酵母细胞生长以及对UFAs的吸收,使胞内UFAs含量迅速增加,但抑制饱和脂肪酸(C4:0—C24:0)的合成。分析UFAs对葡萄酒香气物质的影响发现,高浓度UFAs能够促进酵母高级醇和乙醇酯类(包括己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯)香气的产生,但抑制了中短链脂肪酸(medium-chain fatty acids,MCFAs,C4:0—C12:0)的产生,对来源于葡萄果实的醛类、单萜和降异戊二烯香气的影响较小。【结论】提高葡萄汁初始UFAs含量能够促进细胞生长,提高葡萄酒发酵速度,有利于乙醇酯类香气物质的合成,从而增强葡萄酒的果香、花香和甜香特征。因此,调控葡萄或葡萄汁中不饱和脂肪酸浓度可以作为调控葡萄酒香气品质的一种重要手段。
    不同乳酸菌发酵对桂圆肉中酚类物质及抗氧化活性的影响
    赖婷,刘磊,张名位,张瑞芬,张雁,魏振承,邓媛元
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1979-1989.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.013
    摘要 ( 259 )   HTML ( 1 )   PDF (403KB) ( 429 )   收藏
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    【目的】比较不同乳酸菌种发酵对桂圆肉(干制的龙眼果肉)中游离态、结合态酚类物质含量和单体酚组成及其抗氧化活性的影响,为开发营养保健的乳酸菌发酵龙眼新产品提供参考。【方法】将桂圆肉打浆(料水比为1﹕1.5)后作为发酵基质,进行高温湿热灭菌,再分别接入7种不同乳酸菌(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、明串珠菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和干酪乳杆菌,菌浓度:8.0—9.0 lg CFU/mL),接种量为1%,在30℃下静置发酵48 h(pH 4.0—4.2),然后对发酵前后桂圆肉中游离态和结合态总酚、总黄酮含量的变化进行分析,采用高效液相色谱法分析其单体酚类的组成及含量的变化,采用铁离子还原能力(ferric reducing abi1ity of plasma,FRAP)和氧自由基吸收能力(oxygen radical absorption capacity,ORAC)两种方法评价其体外抗氧化能力差异。【结果】7种乳酸菌发酵均能不同程度增加桂圆肉中游离态总酚和总黄酮含量,降低结合态总酚和总黄酮含量。与发酵前相比,发酵后桂圆肉游离态总酚含量增加0.4%—11.9%,结合态总酚含量下降14.4%—41.4%;游离态总黄酮含量增加2.8%—19.6%,结合态总黄酮含量下降19.6%—70.6%。但不同菌种对其影响存在差异,其中植物乳杆菌释放桂圆肉中结合态酚类物质的能力最强,使游离酚含量增加11.9%,结合态酚含量下降41.4%,游离态总黄酮增加19.6%,结合态总黄酮下降70.6%。不同乳酸菌发酵对桂圆肉中单体酚(没食子酸、丁香酸、表儿茶素、高儿茶酚、原儿茶酸、对香豆酸和异槲皮苷)含量影响亦存在显著差异(P<0.05),其中发酵后的游离态的没食子酸和高儿茶酚含量分别增加8.6%—69.8%和0.4%—29.5%,结合态的没食子酸和高儿茶酚含量分别下降80.0%—88.3%和45.6%—73.9%。而乳酸菌发酵后,桂圆肉游离态FRAP和ORAC抗氧化能力与发酵前相比也有显著提高(P<0.05),其中植物乳杆菌发酵后,游离态FRAP和ORAC抗氧化能力分别提高11.8%和59.1%。【结论】乳酸菌发酵能提高桂圆肉中游离态酚类物质含量,降低结合态酚类物质含量,同时提高其抗氧化能力。植物乳杆菌在发酵桂圆肉的过程中,其释放结合态酚类物质的能力明显优于其他乳酸菌,其发酵后桂圆肉的抗氧化能力也有明显提高。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    山羊PRNP基因启动子转录活性研究
    周荣艳,魏彦辉,锡建中,李兰会,陈 辉,高立杰,张振红
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1990-1997.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.014
    摘要 ( 184 )   HTML ( 1 )   PDF (2144KB) ( 303 )   收藏
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    【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列(GenBank登录号:EU870890)为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519—+82 bp,且在-220—+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域(-519—+82bp),外显子1对启动子活性起重要的调控作用。
    山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达
    占思远,董 尧,李 利,仲 涛,王林杰,张红平
    中国农业科学. 2016, 49(10):  1998-2007.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.015
    摘要 ( 198 )   HTML ( 1 )   PDF (3881KB) ( 400 )   收藏
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    【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2(Insulin-like growth factor binding protein -2)基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的GenBank数据库中公布的绵羊(Ovis aries,NM_001009436)和牛(Bos taurus,NM_174555)的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR(Q-PCR)引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交(Western blotting)方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织(心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌)和不同发育阶段(3、30、60、90和120 d)的表达情况。【结果】①克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲(68.14%)、α-螺旋(18.30%)和延伸链(13.56%)三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB(IGFBP homologues)和TY(Thyroglobulin type Ι repeats)结构域,IB结构域位于第37—125位氨基酸处,TY结构域位于第250—302位氨基酸处;②磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser(5)和Thr(7)共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;③CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;⑤组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种“上升-下降-上升”的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。
    猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞产生IFN-β的信号通路研究
    张新晨,赵其岭,陈萌萌,孙嘉瑞,鲍恩东,张书霞,吕英军
    中国农业科学. 2016, 49(10):  2008-2016.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.016
    摘要 ( 266 )   HTML ( 2 )   PDF (587KB) ( 328 )   收藏
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    【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795(TBK1/IKKε抑制剂)组、BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)组和BX795+BAY 11-7082(混合抑制剂)组。 BX795组、BAY 11-7082组、BX795+BAY 11-7082组分别用0.5µmol BX795、5µmol BAY 11-7082、0.5µmol BX795+5µmol BAY 11-7082预先处理1h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72h收集细胞,提取RNA。用荧光定量PCR检测IFN-β、模式识别受体(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA含量。【结果】PCV2感染PK-15细胞后,IFN-β的mRNA含量在48、72h显著升高(P<0.01),表明PCV2感染可以诱导PK-15细胞生成IFN-β;TLR3的mRNA含量在48h显著升高(P<0.01),TLR9的表达量在48、72h显著升高(P<0.01);TLR3和TLR9下游的接头蛋白MyD88和TRIF的mRNA含量在48h显著升高(P<0.01),表明PCV2激活了Toll样受体介导的NF-κB信号途径;MDA-5的mRNA含量在48、72h显著升高(P<0.01),RIG-1的mRNA含量在72h显著升高(P<0.01),MDA-5和RIG-1下游的接头蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA含量在48h显著升高(P<0.01),表明PCV2激活了RIG-1样受体介导的IRF3信号途径;DAI的mRNA含量在48、72h显著升高(P<0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式识别受体介导的IRF3信号途径;分别用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介导的信号通路,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA含量与PCV2组相比无显著性差异(P>0.05),TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA含量与PCV2组相比明显下降(P<0.05),表明PCV2诱导IFN-β的产生主要由IRF3信号途径调控。【结论】PCV2感染可以诱导PK-15细胞中IFN-β表达量的上调,其上调主要与IRF3信号通路有关。
    2014-2015年中国部分地区蜜蜂慢性麻痹病病毒流行病学调查及系统发育分析
    贾慧茹,吴艳艳,王强,代平礼,周婷
    中国农业科学. 2016, 49(10):  2017-2026.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.017
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    【目的】前期笔者课题组对北京地区蜂群进行了常见病毒感染情况的调查,发现蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)在病蜂群中的检出率显著高于在健康蜂群中的检出率,据此推测可借助病蜂群对CBPV进行研究。鉴于目前国内CBPV流行病学数据的匮乏,论文旨在了解中国主要养蜂区病蜂群中CBPV的分布及遗传变异情况,以期为该病的防控提供依据。【方法】2014—2015年间从四川、安徽、浙江、河南、山东、山西、黑龙江、北京8个主要养蜂省(市)共采集到136份病蜂样品,采用RT-PCR法检测CBPV的感染情况。每份样品随机选取10只蜜蜂,取其头部,利用Trizol法提取样品的总RNA;通过凝胶电泳及NanodropND-2000对总RNA的质量进行定性与定量检测。以样品总RNA为模板合成cDNA第一条链,而后以cDNA为模板扩增CBPV的特异性片段。所有扩增片段均进行琼脂糖凝胶电泳,对部分阳性样品进行测序与序列分析;通过扩增片段与阳性片段的比对确定每份样品中CBPV的检出情况。为研究CBPV中国分离株的系统发育特性,以样品cDNA为模板,扩增全部阳性样品的RdRP基因(RNA-dependent RNA polymerase)特异性片段,而后进行测序与序列分析。将序列提交至GenBank获取基因登录号。对获得的分离株的RdRP基因与GenBank上发表的相应序列进行比较分析,利用CLUSTAL W软件对全部参考序列及本研究获得的分离株的对应序列进行同源性比对,应用软件MEGA 6.0 中邻接法(neighbor-joining)对所有序列绘制系统进化树。【结果】蜜蜂头部总RNA质量检测结果显示,所有样品的总RNA相对完整,且浓度处于(980.5±37.1)ng·L-1范围内,A260/A280 在1.92—2.24。CBPV感染率检测结果显示,136份病蜂样本中共检出120份CBPV阳性样品,阳性率高达88.2%。全部阳性样品的电泳结果可见与预期大小一致的特异性片段,其序列与靶序列同源性达到99%以上。RdRp基因特异性片段的序列分析表明,本研究共获得8个CBPV中国分离株,其序列与多种其他地区的CBPV的相应序列同源性达到97%以上。中国分离株GenBank登录号分别为KT374042—KT374049。对其系统进化树分析后可知,世界流行的CBPV分离株可分为5个进化分支:两个欧洲分支(European clade 1、 European clade 2),两个中日混合分支(Chinese -Japanese clade 1、Chinese-Japanese clade 2)和一个美国分支(US clade)。获得的8个中国分离株均存在于同一进化分支上,且与之前得到的6个江苏分离株以及4个日本分离株共同形成两个混合分支。【结论】进一步证实了中国病蜂群中普遍存在CBPV感染;系统进化关系表明,目前国内CBPV分离株之间的遗传关系无明显地域性特征,与日本分离株亲缘关系较近。有关CBPV的监测工作亟需加强,且其预警作用需引起重视。
    家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用
    赵朋,王叶菁,位曙光,刘莉娜,李珍珍,赵萍,何华伟
    中国农业科学. 2016, 49(10):  2027-2038.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.018
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    【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕(Bombyx mori)5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构; Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。