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当期目录

    2016年 第49卷 第9期 刊出日期:2016-05-01
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    两系法杂交稻两优培九育种的理论与实践
    吕川根,邹江石
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1635-1645.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.001
    摘要 ( 669 )   HTML ( 1 )   PDF (2481KB) ( 619 )   收藏
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    两系法超级杂交稻两优培九是中国独创的两系法杂交稻育种中形成的品种,是中国超级稻育种计划完成第一步目标的标志性品种,是继三系杂交稻汕优63之后种植面积最大的杂交稻,在国内外具有重大影响。两优培九的育种实践经历了艰苦曲折的科研攻关和推广过程。最初是尝试通过化学杀雄制种的方法利用典型籼粳杂种的优势,在亚优2号的育种实践失败后,技术路线调整为通过光温敏两系法将部分亚种间杂种优势与江淮生态区的水稻理想株型相结合,克服杂交稻结实率不高、不稳等弱点,达到高产、优质、多抗、适应性广泛并能安全制种的目标。通过分析多个水稻光温敏不育系与不同生态型父本配组的杂种F1的性状表现,确定以带有1/4爪哇稻亲缘的培矮64S为重点母本,选择优势生态群中的合适类型父本重点配组,避开生育期超长和植株偏高等障碍性问题,并根据江淮流域一季稻区的常年气候特点进行生态育种。通过大量筛选,育成两优培九,达到遗传、形态和功能“三优”的统一,将优质、超高产、多抗性状聚集于一体。通过对培矮64S育性转换、开花授粉有危害的高温、低温指标的研究和对各生态区常年气候中出现这些温度频率的分析,提出适宜制种区域和相应的父母本安全抽穗期。研究培矮64S育性转换的植株温度指标,提出遭遇低温危害时“以水调温”的制种纯度保障技术。通过对两优培九的生物学特性和适宜生长条件的研究,提出适宜种植区、各种植区的适宜齐穗期和主要种植方式的播栽期等生产指导性指标,分析生产上可能发生的问题并提出相应的预防措施和解决对策,研发提高结实率及其稳定性的栽培技术。通过配套生产技术的系统研究和应用,两优培九在南方稻区多年大面积成功种植。通过全程回顾育种战略的形成、研究思路和技术路线、品种培育和核心配套技术的研发及示范推广过程,论述了两优培九育成和大面积应用的意义;补充了水稻理想株型中的茎秆分布性状,提出“渔叉型”茎秆分布的概念;认为可以利用籼粳米质性状的互补选择各种适口性的稻米;大面积成功推广一个品种,尤其要加强应用技术研究,前瞻性地研究品种的最适生长条件,然后根据各地的气候条件规划最适种植区,并制定相应的最优栽培措施,还要储备可能发生问题的预防措施和解决对策。
    大豆百粒重QTL定位及多样性评价
    陈 强,闫 龙,冯 燕,邓莹莹,侯文焕,刘 青,刘兵强,杨春燕,张孟臣
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1646-1656.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.002
    摘要 ( 365 )   HTML ( 1 )   PDF (856KB) ( 653 )   收藏
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    【目的】百粒重是大豆重要的育种目标性状,它不仅是产量构成因子之一,也是重要的品质性状,不同用途对百粒重有着不同要求。通过连锁分析定位大豆百粒重QTL,获得连锁标记,阐明QTL连锁标记在种质资源中的多样性特征,为百粒重定向改良提供依据。【方法】以冀豆12×黑豆(ZDD03651)杂交衍生的188个重组自交系的F6:8和F6:9群体为材料,采用WinQTL Cartographer V. 2.5的复合区间作图法(CIM),经300次Permutation 计算,以P=0.05显著性水平确定QTL存在的阈值,定位百粒重QTL。连续3年在石家庄对来自国内外的205份大豆育成和地方品种的百粒重进行表型鉴定,利用定位到的百粒重QTL连锁SSR标记对种质资源材料进行基因型分型,在每个标记处确定发生频率大于5%(对应资源材料个数大于10个)的等位变异为有效等位变异,计算等位基因多样性指数,明确百粒重QTL在种质资源里的多样性特征,通过多重比较确定不同等位变异与百粒重的关系。【结果】在冀豆12×黑豆后代群体中,百粒重呈正态连续分布,遗传力为88.72%。共检测到5个百粒重QTL,分别位于Chr.02(D1b)、Chr.06(C2)、Chr.08(A2)和Chr.17(D2)染色体,遗传贡献率(R2)7.68%—12.83%,加性效应-0.65—-0.84 g,增效基因均来自冀豆12。年份间稳定的QTL有2个,其中,qSW-6-1位于第6染色体Satt457—Sat_062,紧密连锁的标记为Satt281,贡献率最大值为12.02%,加性效应最大值为-0.81g;qSW-17-1位于第17染色体Satt301—Satt310,贡献率最大值为12.83%,加性效应最大值为-0.84g。在205份资源材料中,百粒重遗传力为96.88%。百粒重连锁SSR标记有效等位变异数为2—8个,多样性指数为0.34—0.82。发掘出大粒相关等位变异6个,分别为Satt281-227 bp、Barcsoyssr_2_304-245 bp、Satt301-199 bp、Sat_406-214 bp、Satt119-136 bp和Satt341-218 bp。其中Satt281-227 bp在RIL和资源材料中均为百粒重增效效应,主要分布在国内大粒育成品种中。筛选到含有4个及以上大粒相关等位变异的资源材料3份,分别为绿75、中品大黑豆和中野2号。【结论】在大豆育成品种冀豆12×地方品种黑豆的杂交后代群体中,检测到5个百粒重QTL,冀豆12含有1个在RIL和种质资源中均为大粒相关的优异等位变异。明确了上述5个QTL在205份育成品种和地方品种间的多样性分布特征,可应用于百粒重定向改良过程中的亲本选配及后代选择。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    地表覆盖对旱地小麦氮磷钾需求及生理效率的影响
    何刚,王朝辉,李富翠,戴健,李强,薛澄,曹寒冰,王森,刘慧,罗来超,黄明
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1657-1671.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.003
    摘要 ( 369 )   HTML ( 1 )   PDF (401KB) ( 477 )   收藏
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    【目的】研究地表覆盖对黄土高原旱地冬小麦氮磷钾需求和生理效率的影响,为促进黄土高原旱地冬小麦高效优质生产提供可靠的理论依据和实践经验。【方法】通过田间试验,以裸地休闲为对照,研究地膜覆盖、秸秆覆盖、种植绿肥和秸秆覆盖+种植绿肥对冬小麦籽粒产量、籽粒养分含量、籽粒产量形成和籽粒养分含量形成的氮磷钾需求及生理效率的影响。【结果】地膜覆盖降低了籽粒产量形成的需氮量,提高了籽粒产量形成的氮生理效率,从而使冬小麦籽粒产量显著增加6%;秸秆覆盖降低了地上部吸氮量,使籽粒产量减少7%;种植绿肥和秸秆覆盖+种植绿肥提高了籽粒产量形成的氮磷钾养分需求量、降低了籽粒产量形成的养分生理效率,从而使籽粒产量均减少5%。地膜覆盖提高了籽粒氮含量形成的需氮量,降低了氮生理效率,从而使籽粒含氮量降低8%,地膜覆盖增加了地上部吸钾量,使籽粒含钾量增加4%;秸秆覆盖的籽粒含氮量降低4%,但它的籽粒磷和钾含量分别提高6%和4%,这与降低籽粒磷钾含量形成的养分需求量、提高磷钾生理效率有关;种植绿肥提高了籽粒氮含量形成的氮生理效率,从而使籽粒氮含量增加8%;秸秆覆盖+种植绿肥对籽粒氮和磷含量无显著影响,但籽粒含钾量增加4%,归因于提高了籽粒钾含量形成的钾生理效率。【结论】地膜覆盖降低籽粒产量形成的需氮量,提高籽粒产量形成的氮生理效率,从而提高籽粒产量;但增加了籽粒氮含量形成的需氮量、降低了籽粒氮形成的氮生理效率,不利于籽粒含氮量提高。秸秆覆盖不利于作物养分吸收,从而影响籽粒产量和养分含量形成。种植绿肥和秸秆覆盖+种植绿肥提高了籽粒氮磷钾养分需求量、降低它们的生理效率,从而降低籽粒产量。种植绿肥可提高籽粒氮含量形成的氮生理效率,从而提高籽粒氮含量。因此,旱地小麦生产中为保证籽粒产量和营养品质,需增加地膜覆盖和秸秆覆盖的氮肥用量;夏闲期种植绿肥是旱地土壤培肥的重要措施,但需注意其可能带来的减产风险,应结合区域降水情况因地制宜。
    喷施化学打顶剂对棉花冠层结构及群体光合生产的影响
    杨成勋,张旺锋,徐守振,随龙龙,梁福斌,董恒义
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1672-1684.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.004
    摘要 ( 294 )   HTML ( 1 )   PDF (982KB) ( 413 )   收藏
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    【目的】选用氟节胺复配型、缩节胺复配型2种化学打顶剂,研究田间喷施化学打顶剂对棉花株型特征、冠层结构、群体光合生产及产量的影响,分析冠层结构变化对群体光合生产和产量的影响,为棉花化学打顶技术的应用提供理论依据。【方法】选用北疆棉区主栽品种(新陆早45号)和主推品种(系)(中棉所50、45-21)为试验材料,在田间自然条件下,以常规人工打顶的棉花为对照,分别测定不同棉花品种(系)株高、株宽、叶面积指数、叶片叶绿素含量、冠层不同部位透光率、群体光合速率及产量构成等指标。研究化学打顶技术对棉花叶面积指数、冠层透光率、群体光合速率及产量的影响。【结果】与人工打顶的棉花相比,化学打顶的棉花株高显著高于人工打顶处理,且喷药后生长量较大;株宽显著小于人工打顶处理,喷药后横向生长被明显抑制。化学打顶的棉花叶面积指数和叶片叶绿素含量较高,且高值持续期长,至初絮期(出苗后115 d)仍维持较高的值,与人工打顶的棉花相比差异均达到极显著水平;冠层上、中部透光率较高,生育后期冠层下部漏光损失较小。化学打顶的棉花群体光合速率显著高于人工打顶,且高值持续期长,至初絮期仍维持在16.04 μmol·m-2·s-1以上,较人工打顶的棉花高出14.35%—36.35%,差异均达到显著水平;群体呼吸速率在达到峰值前显著高于人工打顶的棉花,峰值后与人工打顶的棉花无显著差异;群体呼吸速率占群体总光合速率的比率高于人工打顶的棉花。化学打顶的棉花单株结铃多,其中氟节胺处理棉花产量高于人工打顶。【结论】棉花化学打顶技术具有塑造株型、调节棉花冠层结构形成的重要作用;同时棉花冠层上、中部透光率大,改善了冠层中下部光环境,保证了冠层各部位均匀的光分布。化学打顶的棉花叶面积指数高且高值持续期长,增加了光合面积。叶片叶绿素含量高且高值持续时间长,延长了光合时间,保证了较高的群体光合能力及长的光合功能持续期。
    植物保护
    稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆
    薄惠文,俞咪娜,于俊杰,尹小乐,丁慧,王亚会,刘永锋
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1685-1695.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.005
    摘要 ( 240 )   HTML ( 1 )   PDF (4447KB) ( 384 )   收藏
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    【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。
    二斑叶螨多重抗性品系解毒酶基因表达模式解析
    周兴隆,宋丽雯,杨顺义,李静静,王进军,张新虎,沈慧敏
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1696-1704.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.006
    摘要 ( 185 )   HTML ( 1 )   PDF (478KB) ( 301 )   收藏
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    【目的】二斑叶螨(Tetranychus urticae)是一种重要的农业害螨,由于个体小、繁殖快等特点,极易产生抗药性,论文从生理生化和分子水平探讨二斑叶螨mRNA水平相对表达量的变化,旨在明确二斑叶螨对混剂的多重抗性机制,为该螨的综合治理提供依据。【方法】在温度(25±l)℃,相对湿度60%±5%,光周期L﹕D=16 h﹕8 h的室内条件下,于盆栽豇豆苗上饲养不接触任何药剂的二斑叶螨敏感品系(SS)和用螺螨酯、甲氰菊酯、阿维菌素以其单剂的致死中浓度(LC50)为汰选浓度混合连续汰选的多重抗性品系(Mp-R);Mp-R品系用药4—5次待其种群扩增后,参照FAO推荐的叶片残毒法进行室内毒力测定一次,计算其LC50,求出抗性倍数(RR),并记为一个汰选周期;连续汰选3个周期后,逐渐增加汰选浓度,用PoloPlus软件求其毒力回归方程、LC50、抗性指数及卡方值;采用生化分析法测定选育50代的二斑叶螨SS与Mp-R品系卵、幼螨、若螨、雄成螨、雌成螨的谷胱甘肽S转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)、多功能氧化酶(MFOs)的活性,以ELFn为内参基因,采用RT-qPCR技术以比较Ct值的方法计算二斑叶螨Mp-R品系中10个与抗性相关的解毒酶基因的表达量。【结果】在室内经50代抗性选育,二斑叶螨对阿维菌素、甲氰菊酯及螺螨酯的LC50分别达到1 103.55、5 993.33和2 345.62 mg·L-1,抗性倍数分别为603.03、167.65和51.77倍。卵中Mp-R品系MFOs比活力显著高于SS品系,GSTs、CarEs比活力差异不显著;其他发育阶段Mp-R品系的GSTs、CarEs比活力显著高于SS品系,MFOs比活力则差异不显著;Mp-R品系雌成螨的GSTs、CarEs比活力显著高于其他发育阶段,卵的MFOs比活力显著高于其他发育阶段。与敏感品系相比,二斑叶螨TuGSTd05、TuGSTd06与TuGSTd09基因表达量在Mp-R品系各发育阶段显著上调1.80倍以上,TuGSTd01表达量在若螨期显著上调1.63倍,其他发育阶段差异不显著;CYP392E10表达量在卵中极显著上调5.87倍,幼螨、若螨阶段显著上调2.15倍和2.09倍,成螨阶段表达量差异不显著;CYP392A6在卵、幼螨与若螨阶段表达量均显著上调1.89、1.64和1.59倍,在成螨阶段表达量差异不显著。CYP392A16在各发育阶段均极显著上调,卵中上调6.97倍,幼螨中上调8.20倍,若螨中上调8.88倍,雄成螨上调7.34倍,雌成螨上调8.59倍。CYP392D 8在卵、幼螨和雄、雌成螨中表达量均显著上调2.18、2.00、2.03和2.41倍,在若螨阶段表达量差异不显著;TuCCE35在若螨及雄、雌成螨中表达量显著上调1.58、1.86和2.65倍;TuCCE36在卵和雄、雌成螨中表达量显著上调1.73、1.89和2.14倍。【结论】与敏感品系相比,二斑叶螨Mp-R品系10个与抗性相关的解毒酶基因表达量在其不同发育阶段均有不同程度的变化。CYP392A16表达量在各发育阶段上调较大,可能参与了二斑叶螨多重抗性的形成;其余基因表达量均未见大幅度上调,这些基因是否参与了对3种药剂的代谢还需进一步验证。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    长期施肥处理下不同类型水稻土有机碳矿化的动态差异
    吴 萌,李忠佩,冯有智,陈瑞蕊,江春玉,刘 明
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1705-1714.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.007
    摘要 ( 257 )   HTML ( 1 )   PDF (720KB) ( 434 )   收藏
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    【目的】研究田间长期定位施肥处理下不同类型水稻土有机碳矿化的动态差异及其影响因素,为揭示不同类型水稻土有机碳的循环特征及制定合理的养分管理措施等提供依据。【方法】以江苏常熟(乌栅土)、江西余江(低肥力红壤)、湖南望城(高肥力红壤)和重庆(紫色土)4个地点长期定位施肥试验的水稻土为研究对象,选择不施肥(CK)、单施化肥(NPK)和化肥配合秸秆还田(NPKS)3个处理,通过室内27 d的有机碳矿化培养试验,采用室内恒温培养、碱液吸收法测定土壤有机碳的矿化量;选择Jones一级动力学方程拟合土壤有机碳累积矿化量的动态变化,比较土壤类型和长期不同施肥处理对有机碳矿化动态的影响。【结果】长期施肥处理可以提高土壤全量养分(全氮、全磷、全钾)和有机碳含量,但会降低土壤pH。长期施肥可以显著提高土壤有机碳累积矿化量(C)(常熟试验点除外),不同施肥处理下增加幅度为11.7%—86.1%,而对于矿化动力学方程拟合所得土壤潜在可矿化有机碳量(C0)、易矿化有机碳量(C1),只有同为红壤的余江和望城两地的施肥处理可以显著提高。相同施肥处理下C、C0和C1均表现为常熟、望城试验点的较大,重庆、余江试验点的较小,而潜在可矿化有机碳量与土壤有机碳的比值(C0/SOC)则是余江试验点较大;相关性分析发现有机碳、总氮、碱解氮、全磷与C、C0和C1呈极显著正相关(P<0.01),pH和全钾与C呈极显著负相关,而C0/SOC与有机碳、pH和各养分指标均呈显著或极显著负相关。对于矿化速率常数(k),施肥处理对其影响并不显著,但不同土壤类型可以显著影响k。相关性分析表明k与pH、C/N和全钾呈极显著负相关(P<0.01),与速效钾呈显著负相关(P<0.05)。通过聚合推进树(ABT)方法分析了不同因子的相对影响,结果表明碱解氮和有机碳含量对C和C0影响较大,相对贡献率分别为23.8%、20.2%(对于C)和29.5%、23.7%(对于C0);有机碳含量和pH对C1和C0/SOC影响最大,相对贡献率分别为26.7%、15.9%(对于C1)和34.4%、23.0%(对于C0/SOC);pH和全钾对k的影响最大,相对贡献率分别为34.2%和22.1%。【结论】土壤类型对有机碳矿化动态的影响要大于长期施肥措施产生的影响,不同地点长期定位施肥处理下土壤母质、pH、有机碳含量和养分含量等土壤性质的不同,造成了土壤有机碳矿化的动态差异。
    中国不同麦区小麦籽粒硒的含量及调控
    刘慧,杨月娥,王朝辉,李富翠,李可懿,杨宁,王森,王慧,何刚,戴健
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1715-1728.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.008
    摘要 ( 321 )   HTML ( 1 )   PDF (1567KB) ( 409 )   收藏
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    【目的】通过取样调查和田间叶喷硒肥试验,研究中国不同麦区小麦籽粒硒含量状况、硒含量的影响因素以及提高硒含量的农艺措施。【方法】分别于2008—2009、2009—2010、2010—2011年小麦季收集中国不同麦区73份春小麦和582份冬小麦共计655份田间小麦样品,调查籽粒产量并测定籽粒硒含量。于2010—2011年在14个省(市)的30个国家小麦产业技术体系综合试验站开展叶面喷施硒肥试验,设叶面喷施清水或0.017%亚硒酸钠2个处理,于拔节中、末期各喷施1次,完全随机区组设计,重复3次,测定拔节前植株样品的硒含量和收获后籽粒产量和硒含量。【结果】655份小麦籽粒样品平均硒含量为64.6 µg·kg-1,远不能满足以小麦为主食人群对硒的营养需求,变幅为0—821.0 µg·kg-1,春、冬小麦平均分别为67.5和64.2 µg·kg-1。有63%缺硒,19%偏低,仅有8%富硒,未发现有小麦籽粒硒含量达到中毒水平。小麦籽粒硒含量在不同区域表现为北部高于南部、西部高于东部。各地的田间试验表明,叶面喷施亚硒酸钠对小麦籽粒产量没有显著影响,不喷硒和喷硒平均产量分别为6 650和6 649 kg·hm-2。叶喷硒肥使籽粒硒含量显著提高,不喷硒时,籽粒硒含量平均为31.0 µg·kg-1,喷硒116 g·hm-2使籽粒硒含量平均增加到647.8 µg·kg-1,达到了富硒水平,但没有达到中毒水平。每施用1.0 g Se·hm-2,籽粒硒含量平均提高5.3 µg·kg-1,施用51 g Se·hm-2可将小麦籽粒硒含量从平均31.0 µg·kg-1提高到300 µg·kg-1以上。小麦籽粒硒含量不受产量的影响,但不喷硒时籽粒硒含量与0—20 cm土层土壤有效硒含量和拔节前植株硒含量分别呈显著和极显著正相关。土壤有效硒含量在6.3—30.7 µg·kg-1每增加1.0 µg·kg-1,不喷硒时籽粒硒含量平均增加2.1 µg·kg-1,拔节前植株硒含量在0—147.2 µg·kg-1每增加1.0 µg·kg-1,不喷硒籽粒硒含量平均增加0.7 µg·kg-1。喷硒后籽粒硒含量和硒强化指数均与拔节前植株硒含量极显著正相关。拔节前植株硒含量每增加1.0 µg·kg-1,喷硒籽粒硒含量平均增加5.7 µg·kg-1,籽粒硒强化指数平均增加0.043 μg·kg-1(g·hm-2-1。【结论】在农业生产中,通过拔节前土壤施硒提高土壤有效硒水平、在拔节中期或末期叶面喷施硒肥等,均可使植株累积较多的硒,并在灌浆期向籽粒转移,从而提高籽粒硒含量。
    中国主要旱地农田N2O背景排放量及排放系数特点
    徐玉秀,郭李萍,谢立勇,云安萍,李迎春,张 璇,赵 迅, 刁田田
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1729-1743.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.009
    摘要 ( 250 )   HTML ( 1 )   PDF (1364KB) ( 438 )   收藏
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    【目的】收集中国已发表的旱地农田N2O排放田间监测文献并建立数据库,以此为基础解析中国主要旱地农田(小麦地、玉米地、蔬菜地)的N2O背景排放值(不施肥情况下土壤的N2O排放量)和排放系数(EF)及影响因子,为估算区域温室气体清单和提出相应的减排策略提供数据支持。【方法】利用亚组归类和回归分析等方法对主要类型旱地农田N2O背景排放量的影响因子(如土壤全氮含量和土壤碳氮比)及影响EF的因子(如氮肥用量及肥料类型——硝化抑制剂和缓控释肥)进行分析。【结果】(1)中国旱地农田N2O背景排放量为0.70—3.14 kg N2O-N·hm-2;小麦地和夏玉米地的N2O背景排放量和蔬菜地的N2O日背景排放量均随土壤全氮含量增加而增加,并随土壤碳氮比的增加而降低,灌溉促进小麦地N2O背景排放量增加;(2)EF随着无机氮肥用量的增加而增加,不同作物种植类型农田的EF大小依次为蔬菜地(0.61%—1.13%)>夏玉米地(0.50%—0.68%)>春玉米地(0.35%—0.40%)>小麦地(0.22%—0.36%);夏玉米地的EF是小麦地的2倍左右;(3)使用不同种类硝化抑制剂后氮肥的EF均有不同程度的降低,EF降低了34%—60%,EF降低程度依次为:DCD+HQ(58.9%)>NBPT+DCD(52.9%)>DMPP(51.1%)>NBPT(44.1%)>吡啶(39.5%)>DCD(38.9%);硝化抑制剂降低EF的效果在不同旱地农田的表现为:小麦地(60.0%)>蔬菜地(50.6%)>春玉米地(39.6%)>夏玉米地(34.7%);(4)与常规尿素相比,不同类型缓控释肥使得EF降低了15.9%—78.9%,降低次序依次为:长效碳酸氢铵(78.9%)>聚合物包膜尿素(59.8%)>脲甲醛(53.4%)>树脂包膜尿素(44.9%)>硫磺包膜尿素(30.6%)>钙镁磷肥包膜尿素(15.9%);缓控释肥降低EF的效果在不同农田表现为:蔬菜地(78.4%)>春玉米地(58.2%)>小麦地(49.2%)>夏玉米地,控释肥在降低夏玉米地EF的作用较小。【结论】旱地农田N2O排放主要受土壤养分状况(全氮含量和碳氮比)和管理措施(灌溉和施肥)及其他因素的共同影响,应依据不同气候生态区的气候和土壤特点以及作物类型并考虑氮肥用量和类型采取针对性的减排措施,以有效降低农田N2O排放。
    贮藏·保鲜·加工
    薯类加工与营养专题导读:中国薯类加工现状与展望
    木泰华,陈井旺
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1744-1745.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.010
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        薯类作物营养丰富,富含淀粉、膳食纤维、维生素及矿物元素等成分,在改善居民膳食营养结构,提高全民健康素质,保障国家粮食安全等做出了重要贡献,而薯类加工业的发展在促进中国农业的持续增效、农民的持续增收、现代农业的可持续发展中具有不可替代的作用。2014年,中国薯类种植面积约为1 100万hm2,总产量达1.64亿t。目前,中国薯类(甘薯、马铃薯)的种植面积和产量均居世界首位。但其加工比例相对较低,加工产业发展水平与国外发达国家相比还存在一定的差距。以马铃薯为例,欧美等发达国家加工技术比较先进,马铃薯的加工比例高达80%,其相关食品随处可见,主要有马铃薯条、马铃薯泥、脱水马铃薯片(泥、条)、马铃薯全粉等,各种马铃薯食品的生产工艺及配套设备也十分成熟。中国马铃薯加工的主要产品有淀粉、变性淀粉、全粉、速冻薯条、各类薯片及粉丝、粉条、粉皮等产品。据统计,2014年,中国马铃薯加工业消耗马铃薯约1 000万t(约占马铃薯总产量的10%),其中马铃薯淀粉43.4万t、冷冻薯条28.3万t、薯片45万t、全粉25万t、变性淀粉25万t、粉丝粉条等28万t,以及马铃薯方便菜肴食品、马铃薯泥等方便食品10万t,说明中国马铃薯产品已逐渐呈现多元化发展的趋势,但加工比例整体仍偏低。
        相比欧美等发达国家,中国薯类淀粉行业普遍存在能耗高、淀粉提取率低、副产物综合利用水平低、资源浪费及环境污染严重等问题。以甘薯淀粉加工能耗为例,中国甘薯淀粉加工设备大多是在仿造国外马铃薯淀粉加工设备基础上制造的,平均淀粉提取率低于85%。中国每年因生产马铃薯和甘薯淀粉而排放的废液约1 650万t,薯渣约550万t,薯皮约110万t,肆意丢弃后造成环境污染;而薯浆中的蛋白、多酚和β-淀粉酶等成分及薯渣中的膳食纤维和果胶等有益副产物未得到有效利用。在薯类全粉加工、生物乙醇发酵以及薯类功效成分等研究方面与世界先进水平也存在较大差距。中国目前加工和销售的薯类产品主要以淀粉和薯条等休闲食品为主,并未将薯类中丰富的营养成分充分利用,对薯类中的功效成分缺乏深入挖掘,缺少适合中国大众普遍消费的馒头、面条等传统主食类的加工产品。因此,在设备的研发和改进上,需重视和借鉴发达国家薯类淀粉及薯类全粉等产品的研发经验,对现有技术和设备进行升级改造,提高中国甘薯淀粉及薯类全粉加工技术和装备的水平。重点针对薯类加工废弃物(薯浆、薯渣、薯皮)以及薯类茎叶的资源化利用展开研究,开拓其在食品、工业领域的应用途径,延长产业链、提高附加值。强化薯类功效成分及新型薯类加工制品的研发。如紫心甘薯和马铃薯中花青素含量较高,其具有较强的抗氧化、抗炎作用,但不同加工处理方式(蒸、煮、烤、炸、微波、超声波等)、环境条件(pH、温度)及提取方法都会影响花青素的提取率、结构组成及功能特性,因此有待在提取技术上加强研发。橙色甘薯中的胡萝卜素含量较高,可用于生产甘薯面包和馒头作为缺乏VA人群的重要膳食补充。此外,以甘薯、马铃薯为原料直接生产乙醇及其他发酵饮料,也将成为开发新型生物能源及新型薯类加工制品的重要研究方向。 
        2015年,中国启动“马铃薯主粮化关键技术体系研究与示范”公益性行业(农业)科研专项项目,中央财政安排1亿元专项资金用于马铃薯主食产品开发;2016年,中央又将“积极推进马铃薯主食开发”列入中央1号文件,为薯类加工产业的发展提供了良好的平台。目前,中国科研人员在薯类品种选育、原料生产、产品加工、营养评价等方面已取得一批科研成果。研发含薯类成分的馒头、面条、米粉等具有中国特色的主食产品并实现产业化生产和规模化消费,可以丰富中国居民的营养膳食,有力促进中国薯类产品的消费,大幅提高薯类主食产品消费的比重,推动马铃薯和甘薯从杂粮副食转变为与三大主粮协调发展的第四大主粮。
        本专题将从薯类蛋白提取、薯渣发酵技术、甘薯营养成分鉴定等方面展开评述,旨在为薯类产品加工、新型生物能源开发等提供参考。
    马铃薯块茎特异蛋白Patatin的研究进展
    张笃芹,木泰华,孙红男
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1746-1756.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.011
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    马铃薯是仅次于小麦、水稻和玉米的第四种主要作物,中国是世界马铃薯产量最大的国家。目前,随着马铃薯加工业的发展,对马铃薯的研究也在不断深入。马铃薯块茎特异蛋白Patatin是马铃薯块茎的贮藏蛋白,是马铃薯蛋白的主要组成部分。除具有酯酰基水解活性(lipid acyl hydrolase,LAH)和抗氧化活性外,Patatin还具有较好的溶解度、乳化性、起泡性及凝胶性等物化与功能特性,是目前备受关注的植物蛋白之一。文中通过介绍Patatin的分子量、结构特性、物化与功能特性,归纳和比较Patatin的分离、提取及纯化方法以及各自的优缺点,旨在为Patatin在食品领域的进一步研究和开发应用提供理论参考。Patatin在马铃薯蛋白中含量约为5.4%—38.0%,与马铃薯品种及代谢生理等有关,Patatin分子量在39—45 kDa,大小与糖基化程度有关;Patatin是一种结构紧凑的球蛋白,一级结构由360多个氨基酸组成,一级结构不受外界环境因素的影响,而高级结构易受温度、pH等的影响。Patatin具有较好的溶解度、凝胶性、乳化性、起泡性及抗氧化活性等,且这些物化与功能特性均受外界环境因素的影响。凝胶色谱法和离子交换色谱法是进一步分离和纯化Patatin最常用的方法,反向色谱、免疫亲和层析及基因表达法等可获得纯度较高的Patatin,但无法进行大规模生产,膨化床法可用于大量制备纯度不高的Patatin。目前国内外关于Patatin在食品领域中应用的研究十分缺乏。Patatin是一种可应用于食品领域的极具潜力的食品配料,未来对于马铃薯块茎特异蛋白Patatin的研究应继续朝着简化提取方法,降低提取成本,开发具有高功能价值的食品、保健产品及药品的方向发展。
    酶法降黏工艺在鲜甘薯直接发酵制备乙醇中的应用
    岳瑞雪,钮福祥,孙 健,徐 飞,王洪云,朱 红,张 毅
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1757-1766.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.012
    摘要 ( 166 )   HTML ( 1 )   PDF (404KB) ( 237 )   收藏
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    【目的】建立鲜甘薯料液的酶法降黏工艺,并实现鲜甘薯料液不加水直接发酵制备乙醇。【方法】从中国甘薯主产区选择12个种植范围较广的淀粉型甘薯品种作试验材料。分析甘薯主要成分(干物质、淀粉、蛋白质、可溶性糖、果胶、半纤维素、纤维素和木质素)与鲜甘薯料液黏度的相关性并选择对应的降黏酶。研究料水比(1﹕0、2﹕1、3﹕2、5﹕4和1﹕1)、酶处理时间(1、2、3、4和5 h)、酶添加量(纤维素酶:1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 GCU·g-1;果胶酶:1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U·g-1)和酶处理温度(30℃、40℃、50℃、60℃和70℃)对酶法降黏效果的影响。通过正交试验确定最佳酶处理条件,并分析其在不同品种鲜甘薯直接发酵制备乙醇中的效果。【结果】对于12个供试淀粉型甘薯品种,在所有组分中,除了半纤维素(r=-0.239)和木质素(r=-0.069)外,其他组分均与黏度呈正相关(干物率,r=0.356;淀粉,r=0.211,可溶性糖,r=0.307;蛋白质,r=0.266;果胶,r=0.526;纤维素,r=0.600)。其中,果胶(P<0.01)和纤维素(P<0.05)与料液黏度分别呈极显著和显著正相关性。根据极差分析发现,对酶处理效果影响由大到小的酶处理条件分别为酶用量、料水比、酶处理时间和酶处理温度。基于正交试验结果并考虑到工业应用的实际情况,确定最佳酶处理条件为:料水比1﹕0、纤维素酶1.5 GCU·g-1、果胶酶1.5 U·g-1、温度50℃、作用3 h。经过酶处理后,鲜甘薯料液黏度明显下降。除皖苏178号(4 930 cp)外,其余品种的料液黏度在经过酶处理后均低于3 000 cp,降黏幅度95.07%—99.31%。乙醇发酵结束后,11个甘薯品种的乙醇含量均高于12%(v/v),其中有9个品种的发酵效率达到90%以上。【结论】果胶和纤维素是造成甘薯料液黏度高的主要成分。在液化前通过添加纤维素酶和果胶酶可以有效降低鲜甘薯料液黏度,并实现鲜甘薯料液不加水直接发酵制备乙醇。
    鼠李糖乳杆菌利用甘薯废渣发酵产乳酸的研究
    刘玉婷,吴明阳,靳艳玲,沈维亮,方扬,赵海
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1767-1777.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.013
    摘要 ( 238 )   HTML ( 1 )   PDF (566KB) ( 378 )   收藏
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    【目的】研究鼠李糖乳杆菌发酵甘薯淀粉加工废渣生产乳酸的工艺条件,为薯渣的治理和利用提供新的技术思路。【方法】使用元素分析仪对甘薯淀粉废渣中的主要元素进行分析测定,同时,在以菌体OD值法确定的鼠李糖乳杆菌的生长对数期内分别取不同时间点设置4组乳酸发酵试验,以该菌利用葡萄糖液体培养基产乳酸的发酵效率为考察指标确定该菌的乳酸发酵最适种龄。在此基础上,利用鼠李糖乳杆菌对甘薯废渣直接进行固体发酵:采用单因素试验方法分别考察接种量、发酵温度、碳酸钙添加量,以及外加氮源对乳酸发酵效率的影响;此外,考察外加氮源对发酵结束后薯渣固体发酵醪中的生物量的影响;结合正交试验设计,得到影响薯渣发酵产乳酸因素的最优组合。【结果】元素分析结果显示甘薯淀粉废渣是一种高C、H含量的生物质,其干渣中C、H元素质量百分含量分别达40.34%、6.16%,而N元素质量百分含量仅为0.32%,虽C元素含量丰富,但N元素相对匮乏,需要外加氮源方可进一步促进其生长代谢。通过菌体OD值法确定的鼠李糖乳杆菌的生长曲线显示,菌体接入2 h后OD值迅速增长,菌体生长进入对数期。8 h后OD值基本不变,菌体进入稳定期。确定了种子的对数生长期在2—8 h。在该时间区间内以4 h龄种子的乳酸发酵效率最高,达92.39%,对应残糖浓度最低,为0.59 g·L-1,确定4 h是鼠李糖乳杆菌乳酸发酵的最适种龄。薯渣固体发酵中分批单因素试验结果依次为:接种量在10%时发酵效率达最高,为83.87%;发酵温度在37℃时发酵效率最高,达85.55%;CaCO3添加量在5%时发酵效率达最大值,为90.24%;4种无机氮源中尿素组发酵效率达91.01%;尿素在0.8%添加量下发酵效率最大值为94.13%,同时发酵醪中活菌数达4.32×108 cfu/g。依据以上单因素试验结果,CaCO3适宜添加量为5%,与中和发酵体系中初始糖(10%)产生的乳酸所需的理论添加值相符,故以5%作为其固定添加量,不再列入正交试验的考察范围。此外,加入了纤维素酶作为考察因素,确定正交试验因素与水平,开展四因素三水平的正交试验,最终确立了最适薯渣发酵条件:接种量10%、尿素添加量0.8%、纤维素酶含量0.4%、发酵温度35℃、碳酸钙添加量5%,在该条件下发酵效率可达(96.55±0.866)%,发酵醪中活菌数达3.04×108 cfu/g。【结论】建立了低成本、简工艺、高效率的甘薯废渣发酵生产乳酸工艺。该工艺不仅适于工业化生产乳酸,同时易于被广大甘薯淀粉加工农户利用。
    NaCl浓度和pH对甘薯蛋白肽乳化特性的影响
    崔珊珊,木泰华,孙红男,张苗,陈井旺
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1778-1786.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.014
    摘要 ( 158 )   HTML ( 1 )   PDF (745KB) ( 345 )   收藏
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    【目的】明确不同NaCl浓度和pH对甘薯蛋白肽乳化特性的影响,为甘薯蛋白肽在食品工业中的应用提供理论依据。【方法】测定不同NaCl浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)和不同pH(3、5、7和9)条件下,甘薯蛋白肽乳化液的显微结构、乳化颗粒平均粒径(d4,3)、乳化活性、乳化稳定性、流变学性质和甘薯蛋白肽的表面疏水活性。【结果】与未添加NaCl的相比,添加浓度为0.2 mol·L-1NaCl时,甘薯蛋白肽乳化液的d4,3由54.19 μm增大至59.70 μm;乳化活性指数由86.29 m2·g-1显著降低为56.35 m2·g-1P<0.05);乳化稳定性指数由14.84 min降为13.19 min。然而,随着NaCl浓度的增大,甘薯蛋白肽乳化颗粒均一程度降低,d4,3进一步由0.2 mol·L-1时的59.70 μm增加至69.72 μm;而乳化活性由56.35 m2·g-1逐渐降低至32.32 m2·g-1,乳化稳定性呈先升高后降低的趋势,在0.4 m2·g-1时达最大值,为15.55 min;初始表观黏度增大,并有剪切变稀现象发生;表面疏水活性降低。此外,随着pH增加,乳化颗粒均一程度升高,d4,3由pH 3时的64.45 μm减小至pH 9时的51.21 μm;而乳化活性由pH 3时的3.99 m2·g-1升高至pH 9时的120.47 m2·g-1,乳化稳定性呈先降低后升高的变化趋势,pH 3时其最佳值为29.13 min;初始表观黏度降低,并有剪切变稀现象发生;表面疏水活性升高。【结论】甘薯蛋白肽的乳化特性与NaCl浓度和pH密切相关,添加0.2 mol·L-1 NaCl降低了甘薯蛋白肽的乳化活性和稳定性,而增加pH可有效提高甘薯蛋白肽的乳化活性。
    ‘宁紫薯1号’花青素组分鉴定及其对大鼠高脂诱导肥胖的预防效果
    张 毅,王洪云,钮福祥,孙 健,徐 飞,朱 红,岳瑞雪
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1787-1802.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.015
    摘要 ( 197 )   HTML ( 3 )   PDF (1719KB) ( 319 )   收藏
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    【目的】紫甘薯是天然抗氧化物花青素的重要来源。鉴定‘宁紫薯1号’花青素(PSPC)组成成分,探索紫甘薯花青素对高脂诱导肥胖的预防效果并探讨其分子机制。【方法】通过液质联用技术分析紫甘薯新品种‘宁紫薯1号’的花青素组分;采用pH示差法测定制备的样品中总花青素含量。建立因高脂摄入过多导致机体产生营养性肥胖的动物模型,并灌胃不同剂量的紫甘薯花青素比较其预防肥胖效果。每周定时测量大鼠禁食6 h后的体重,通过试剂盒检测大鼠血清样品血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的含量,采用酶联免疫法检测瘦素(Leptin)含量。通过荧光定量PCR法(RT-PCR)检测下丘脑样品瘦素及其受体的mRNA表达,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测瘦素及其下游蛋白的信号表达。【结果】分离鉴定出11种PSPC组分,其中10种为已知的矢车菊素和芍药素酰基化衍生物,峰1为新发现的1种化合物。制备的花青素样品中矢车菊素-3-葡萄糖苷含量为17.4%。体重指标直接表明高剂量花青素组预防肥胖效果最好,为(358.2±20.1)g,中剂量组其次,为(371.6±16.3)g;效果最差的为低剂量组,体重为(384.0±7.2)g。紫甘薯花青素各剂量组大鼠血糖、甘油三酯和总胆固醇的3项血生化指标均趋于正常水平,有效预防肥胖的发生。血清瘦素检测结果显示,高脂组比对照组多释放65.50%;低剂量、中剂量和高剂量紫甘薯花青素组血清瘦素含量分别为(3.13±0.05)、(2.84±0.12)和(2.64±0.06)ng·mL-1,与高脂组相比均显著下降。同时不同剂量紫甘薯花青素组下丘脑中瘦素及瘦素受体的mRNA表达均显著高于高脂组。而高剂量紫甘薯花青素组可以调节下丘脑中瘦素信号,从而降低下游腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)的磷酸化。【结论】高剂量紫甘薯花青素可以通过调节下丘脑中leptin/AMPKα信号通路有效抑制高脂诱导肥胖的形成。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    猪cGAS基因的克隆与原核表达
    杜丽丽,樊爽爽,李赛赛,陈佩格,陈 磊,孙士平,樊文杰,王 江,王月影,钟 凯
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1803-1809.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.016
    摘要 ( 200 )   HTML ( 1 )   PDF (1062KB) ( 458 )   收藏
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    【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使cGAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪cGAS基因的重组质粒pBbB3a-His6-NusA-cGAS,进行原核表达,得到cGAS蛋白,为进行体外催化合成cGAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏cDNA为模板克隆猪cGAS的蛋白编码区 (open reading frame, ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21 (DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-NusA-cGAS融合蛋白,用20 mmol·L-1丙酸钠在20℃180 r/min分别诱导0, 2, 4, 6, 8, 10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 mmol·L-1的丙酸钠在20℃180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L-1丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】(1)本试验成功克隆了猪cGAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了cGAS丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-cGAS;(3)His6-NusA-cGAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L-1丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。(4)His6-NusA-cGAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 kD。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了cGAS融合蛋白,本试验为体外表达cGAS融合蛋白提供技术方法。
    小鼠角蛋白10(K10)基因启动子的克隆及活性分析
    张俊珍,刘 彧,姬凯元,杨姗姗,胡帅鹏,刘学贤,范瑞文
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1810-1817.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.017
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    【目的】角蛋白10 (K10) 是黑色素细胞中黑素体向周围角化细胞迁移的分子标记之一,在研究基因在黑色素细胞与角化细胞相互作用的功能时,可以作为特异的启动子。本研究欲筛选K10较强的启动子片段,为研究K10以及相关基因的功能提供理论依据和奠定理论基础。【方法】从小鼠尾巴提取基因组DNA,经质量鉴定后,采用PCR法扩增K10的6个不同片段(F1—F6),并将其分别亚克隆到pMD18-T载体,经测序验证是否正确;将K10的6个亚克隆片段再克隆到pGL0载体中,产生pGL0 - F1—F6构建,用脂质体法转染293T细胞,转染结束后将细胞裂解,并通过双荧光素酶报告基因检测6个片段转染细胞后引起的荧光素酶活性变化,以筛选启动效果最好的启动子片段;用筛选到的K10启动子片段作为特异启动子,替换pGL0载体上的CMV强启动子,并与周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)基因进行重组,形成pGL0-F-CDK5构建,用脂质体法转染小鼠皮肤角化细胞,待转染结束后,分别进行细胞爬片、细胞裂解和细胞总RNA的提取,之后用免疫荧光化学、双荧光素酶报告基因检测法和实时荧光定量PCR法检测CDK5的表达定位、表达水平及荧光素酶活性,以检测其在角化细胞中的启动效果;用生物信息法Promoter Scan分析所得到的活性最强的K10启动子片段,发现其可能的转录因子结合位点。【结果】PCR扩增、克隆得到K10启动子的6个片段(F1—F6),片段大小分别为1 201、908、664、787、790、656 bp;质粒pGL0 - F1—F6分别转染293T细胞后,通过双荧光报告检测发现长度为787bp的F4启动子活性最强;但F1—F6启动子的活性均弱于pGL0-basic中CMV的启动活性;F4序列中含有基本启动子保守区域的共同序列即TATAAAA,经Promoter Scan分析发现F4序列中含有C/EBPβ、GATA、HSF、CAP等多个转录因子的结合位点,这些位点利于K10在角化细胞中表达;pGL0-F4-CDK5转染角化细胞后,通过荧光蛋白的表达检测载体上GFP报告基因的表达,发现pGL0-F4-CDK5转染角化细胞后引起GFP的表达量明显强于pGL0-basic-CDK5转染组;同时用荧光素酶活性检测pGL0-F4-CDK5在角化细胞中的启动效果,结果发现pGL0-F4-CDK5转染组的荧光比值明显高于对照组,差异显著(P<0.01);经实时荧光定量PCR检测CDK5的表达变化,结果发现pGL0-F4-CDK5转染角化细胞后引起CDK5 mRNA表达量明显高于对照组,差异呈极显著(P<0.01)。上述结果说明F4具有较强的启动子活性,是K10启动子的核心区。【结论】成功筛选了K10的核心启动子区域F4,在角化细胞里具有启动目标基因CDK5表达的功能,因此,F4可作为黑色素细胞与角化细胞相互作用过程中基因功能研究的特异性启动子,为研究K10基因功能提供理论依据。
    牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立
    王 芳,冯 宇,张 阁,蒋 卉,朱良全,丁家波
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1818-1825.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.018
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    【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10 μg·mL-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。
    研究简报
    放牧强度对高寒草地不同类群土壤动物的群落结构和多样性的影响
    武 崎,吴鹏飞,王 群,文勇立,高艳美,张荣芝,龙 伟
    中国农业科学. 2016, 49(9):  1826-1834.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.019
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    【目的】明确放牧强度对高寒草地生态系统中不同类群土壤动物群落结构和多样性的影响。【方法】2014年9月在川西北红原县的西南民族大学“青藏高原生态保护与畜牧业高科技研究示范基地”内选取轻度放牧(light grazing,LG,15 sheep/hm2)、中度放牧(medium grazing,MG,22 sheep/hm2)、重度放牧(heavy grazing,HG,36 sheep/hm2)及无放牧(对照)(no grazing,NG) 4个样地。使用Vortis便携式吸虫器采集地表小型节肢动物;用环刀采集0—5、5—10和10—15 cm层土样,每层采2份,分别用干漏斗法(Tullgren)和湿漏斗法(Baermann)分别分离土壤节肢动物和土壤线虫。【结果】主成分(PCA)分析结果表明,无放牧处理与其他放牧处理样地间的3类土壤动物群落结构均存在明显差异,说明放牧对土壤动物群落结构具有显著影响;而土壤线虫群落结构在3种放牧强度之间的差异最明显,其次是地表节肢动物,土壤节肢动物群落结构在3中放牧强度间的差异相对最小。3种放牧强度样地中的土壤节肢动物及土壤线虫的群落密度均显著高于无放牧处理样地(P<0.01),而地表节肢动物群落密度则以轻度放牧样地最低。地表节肢动物的类群数随放牧强度增加而增加,但不同放强度间无显著差异(P>0.05);Shannon多样性指数和Pielou均匀度指数均随放牧强度的增加呈先下降后增加的变化趋势,且以无放牧处理最高,中度放牧处理最低,不同放牧强度间具有显著差异(P<0.05)。土壤节肢动物的类群数和Shannon多样性指数均呈先增加后下降的变化趋势,且均是中度放牧强度样地的多样性显著高于其他放牧强度样地(P<0.05);而Pielou 均匀度指数无明显变化趋势(P>0.05)。土壤线虫的类群数以轻度放牧最高,Shannon多样性指数则是随放牧强度增加而下降,Pielou均匀度指数呈先下降后增加的趋势,以中度放牧最低,无放牧处理最高;单因素方差分析结果表明土壤线虫的多样性指数在各放牧处理间均有显著差异(P<0.05)。多元回归分析结果表明地表和土壤节肢动物的密度和多样性指数与土壤化学性质呈显著相关(P<0.05或P<0.01),土壤线虫群落密度和多样性指数与土壤化学性质和放牧强度呈显著相关(P<0.01)。【结论】不同类群土壤动物对放牧强度的响应不同,重度放牧有利于地表节肢动物,中度放牧利于土壤节肢动物,轻度放牧利于土壤线虫。因此在评价放牧对草地生态系统的影响时选取合适的土壤动物类群非常关键。