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当期目录

    2016年 第49卷 第7期 刊出日期:2016-04-01
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用
    景润春,卢洪
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1219-1229.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.001
    摘要 ( 753 )   HTML ( 4 )   PDF (1232KB) ( 1983 )   收藏
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    CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术。总结了CRISPR/ Cas9基因组定向编辑技术的发展历程,并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。CRISPR/Cas系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来质体或者噬菌体。 根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同,已发现的CRISPR/Cas系统可以分为3种不同类型,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅱ型是以Cas9蛋白及导向RNA为核心组份,组成较为简单,是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自CRISPR/Cas9技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后,经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中。CRISPR/Cas9与ZFNs或TALENs一样都是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂,然后通过非同源末端连接或同源重组介导的修复2种方式引入突变。至今,在多种作物中已实现诱导产生多种定点突变(包括插入、缺失或修饰等),并可获得较高的突变诱导率和可稳定遗传的基因组编辑后代植株。与ZFNs或TALENs技术相比,CRISPR/Cas9技术可以实现对基因组中多个靶基因同时进行编辑,从而可以用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因,为其一大优势。由于CRISPR/Cas9技术具有突变诱导率高、成本低、易于操作及可以多重基因编辑等特点,已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。CRISPR技术除了可以对基因组中不同靶基因进行定向编辑以外,还可以广泛地应用于基因表达调控研究、细胞定位运输系统研究及新型RNA沉默系统构建等方面。基因组编辑技术是继转基因技术之后人类对生物进行遗传操作的又一个革命性技术。但是,与转基因技术相比,CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作更加简单、快捷。应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行育种可以不引入外源基因,在进行基因组编辑之后可以不留下转基因的痕迹,从而导致定义转基因生物的不明确性,因此,政府监管部门是否应该按照转基因的管理办法来监管CRISPR/Cas9技术的应用尚有待决定。
    MYB转录因子基因MIXTA及其同源基因功能的研究进展
    张旸,吴佳岩,吴雅妮,汤明威,解莉楠
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1230-1241.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.002
    摘要 ( 350 )   HTML ( 1 )   PDF (3743KB) ( 661 )   收藏
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    被子植物表皮细胞的形态学建成是目前研究工作中较为流行的生物学现象,其大致包括:表皮细胞形状的改变、表皮细胞附属衍生物的形成、根毛和毛状体的分化等方面,根据大量的试验结果总结发现MIXTA及其同源基因的生物学功能与该现象密切相关。MIXTA是编码一个具有R2R3 MYB结构域的转录因子,自从1994年首次报道在金鱼草中被克隆以来,已经受到广泛的关注并在不同种属试验材料中被更深入地研究和讨论。MIXTA最早被证实的调节功能是促进金鱼草花瓣表皮细胞发生锥形化,使花瓣内表皮具有天鹅绒状质感,野生型金鱼草花瓣表面的锥形细胞在MIXTA突变时形状发生显著扁平化,花瓣内表皮的天鹅绒状质感消失,异位表达的MIXTA同时调控锥形细胞和多细胞腺体毛状体在不同组织部位的生长。近几年的研究发现,除金鱼草外,许多物种中都存在一些类似于MIXTA的基因,统称为MIXTA-like,如唐松草、猴面花、番茄、拟南芥等,特别是在拟南芥中,发现了很多与MIXTA具有高度相似性的基因,这些基因的功能与金鱼草中MIXTA的功能大同小异,并且对其下游基因的调节通路研究的较为透彻。同时,MIXTA作为MYB类转录因子可通过与bHLH转录因子及WD40转录因子结合发生互作,以复合物的形式间接地调控花青素的合成。MIXTA的存在可以影响花瓣表面的温度、气味、颜色、湿度、质感、光学特性等一系列生物学特征,并且通过改变植物花瓣的表型间接影响植物的授粉方式,建立自身的防御保护系统,由此体现MIXTA的生物学功能广泛,对其进行研究的生物学意义可见一斑。文章中首先简要介绍了MIXTA的基本结构,利用氨基酸序列比对及系统发生树等生物信息学技术比较分析MIXTA及其同源蛋白的亲源关系以及它们共同具有的R2R3 MYB结构域,然后从表皮细胞形状的改变(主要指表皮细胞锥形化)、表皮附属衍生物的形成(包括表皮蜡质的合成,毛状体和根毛细胞的分化)、参与激素代谢途径进而间接调控表皮细胞形态建成3方面来论述MIXTA及其同源基因的具体生物学功能,最后对MIXTA在农业、观赏园艺的应用及未来的研究方向进行了展望。
    棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析
    王慧飞,孙艳香,冯雪,张一名,杨江涛,马梅芳,陈光
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1242-1253.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.003
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (4094KB) ( 442 )   收藏
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    【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸(L-Cit)和L-精氨酸(L-Arg)含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    不同水旱轮作体系秸秆还田与氮肥运筹对作物产量及养分吸收利用的影响
    张维乐,戴志刚,任涛,周先竹,王忠良,李小坤,丛日环
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1254-1266.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.004
    摘要 ( 366 )   HTML ( 4 )   PDF (916KB) ( 684 )   收藏
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    【目的】通过研究不同水旱轮作方式下秸秆还田与氮肥运筹对作物产量、氮素吸收及氮肥偏生产力的影响,以期为秸秆还田条件下氮肥的合理施用提供理论依据。【方法】2013—2014年在湖北省孝南、松滋、应城等14个县(市、区)开展水稻-油菜和水稻-小麦2种轮作条件下秸秆还田与氮肥运筹田间试验。试验共设置5个处理,分别为氮肥习惯3次施用、氮肥习惯3次施用配合秸秆还田、高量氮肥3次施用配合秸秆还田、氮肥2次施用(后肥前移)、氮肥2次施用(后肥前移)配合秸秆还田。分析秸秆还田条件下不同氮肥运筹对水稻、油菜及小麦产量、生物量、氮素吸收量及氮肥偏生产力的影响。【结果】对比秸秆还田下的2种轮作模式,增施氮肥对稻油轮作系统作物产量、地上部生物量及氮素吸收量无显著影响,而其对稻麦轮作系统的各指标均有显著提高的作用。稻麦轮作下,高量氮肥3次施用配合秸秆还田相比较氮肥习惯3次施用水稻和小麦平均增产量为0.632和0.564 t·hm-2,增产率分别达6.85%和10.67%;地上部生物量分别增加1.50和1.07 t·hm-2,增幅分别达8.11%和9.06%。地上部氮素吸收量分别增加11.54和23.57 kg·hm-2,增幅分别达7.88%和21.28%,稻麦周年氮素吸收总量增加35.11 kg·hm-2,增幅达13.65%。氮肥2次施用配合秸秆还田处理产量和氮素吸收量可以达到或优于氮肥习惯3次施用处理的水平,且以稻麦轮作下效果更为明显,其中水稻和小麦季平均增产量分别为0.439和0.385 t·hm-2,增产率分别达5.12%和7.63%;地上部氮素吸收量分别增加11.09和21.06 kg·hm-2,增幅分别达8.26%和20.82%,稻麦周年氮素吸收总量平均增加32.14 kg·hm-2,增幅达13.66%。就氮肥利用率而言均表现出氮肥的常量投入即可获得较高的氮肥偏生产力(水稻季均值范围52.03—59.29 kg·kg-1,油菜季10.62—11.12 kg·kg-1,小麦季33.63—36.20 kg·kg-1),等氮量投入下秸秆还田效果要明显优于秸秆不还田,且秸秆还田条件下氮肥后肥前移可以提高氮肥利用率。稻油轮作下氮肥习惯3次施用配合秸秆还田相比较氮肥习惯3次施用、氮肥2次施用配合秸秆还田相比较氮肥2次施用水稻季氮肥偏生产力分别增加2.45和4.07 kg·kg-1,增幅分别达4.36%和7.37%,油菜季分别增加0.36和0.49 kg·kg-1,增幅分别达3.38%和4.62%;稻麦轮作下水稻季分别增加3.88和1.64 kg·kg-1,增幅分别达7.46%和3.10%,小麦季分别增加1.60和1.93 kg·kg-1,增幅分别达4.75%和5.65%。与氮肥习惯3次施用处理相比,氮肥2次施用配合秸秆还田处理在稻油轮作下水稻和油菜氮肥偏生产力平均分别增加5.68%和4.00%;在稻麦轮作下水稻和小麦氮肥偏生产力平均分别增加5.12%和7.63%。【结论】综合氮素利用效率来看,在秸秆还田条件下2种水旱轮作模式均可以通过调整氮肥的后肥前移以保证作物达到高产或稳产的目的,同时提高氮肥利用率。
    植物生长调节剂S3307和DTA-6对大豆荚的生理代谢及GmAC的影响
    孙福东,冯乃杰,郑殿峰,崔洪秋,刘春娟,何天明,赵晶晶
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1267-1276.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.005
    摘要 ( 295 )   HTML ( 1 )   PDF (439KB) ( 383 )   收藏
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    【目的】荚是为大豆籽粒发育过程中提供同化物的暂存源器官。大豆荚脱落率高是制约大豆生产的重要因素之一,为进一步探讨化学控制技术提高大豆产量的内在机制,通过研究叶面喷施2种调节剂对大豆荚生理代谢及离区脱落纤维素酶基因(GmAC)表达的影响,为大豆高产、优质、高效栽培提供理论依据。【方法】以大豆品种抗线6号(Glycine max)为材料,在R1期叶面喷施60 mg·L-1促进型调节剂2-N,N-二乙氨基乙基己酸酯(DTA-6)和50 mg·L-1延缓型调节剂烯效唑(S3307),以喷施清水为空白对照,于喷药后35、42、49和56 d选取处理和对照中的大豆豆荚,测定荚中可溶性糖、蔗糖、淀粉、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、脱落纤维素酶(AC)等生理指标。喷药后第5天用剪刀剥取同一处理大豆荚基部与茎相连离层区组织,采用RT-PCR方法测定脱落纤维素酶基因(GmAC)的表达量。【结果】除喷DTA-6后35 d处理的可溶性糖含量高于对照外,其余取样时期DTA-6和S3307处理均显著降低了荚中可溶性糖含量。在喷药后35—49 d,DTA-6和S3307处理荚皮中蔗糖含量低于对照,而在喷药后56 d高于对照。除喷S3307后42 d处理的淀粉含量低于对照外,其余时期DTA-6和S3307处理均增加了荚皮中淀粉含量。在喷药后35、49和56 d DTA-6和S3307处理降低了荚皮中MDA含量。在喷药后35、42和56 d DTA-6和S3307处理提高了荚皮中POD活性。S3307处理在喷药后35、49和56 d降低了荚皮中AC活性,DTA-6处理在喷药后42—49 d降低了荚皮中AC活性。DTA-6处理下调了大豆离区GmAC的表达量,而S3307处理大豆离区GmAC的表达量上调。DTA-6和S3307处理均有效地改善了大豆单株荚数、荚粒数、百粒重等产量性状,2012年和2013年产量分别比对照高6.23%、1.41%和4.83%、5.30%。【结论】DTA-6和S3307处理有利于大豆荚皮中同化物的转运和积累,提高保护酶活性,减少膜脂质过氧化产物,降低了荚脱落关键酶活性,2种处理均有利于大豆荚的建成,并最终提高了大豆产量,其中,以DTA-6处理大豆离区GmAC的表达量下调,DTA-6处理调控效果较好。
    植物保护
    霜霉威胁迫下黄瓜CsWRKY30表达及功能分析
    李胜男,秦智伟,辛明,周秀艳
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1277-1288.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.006
    摘要 ( 225 )   HTML ( 1 )   PDF (2038KB) ( 404 )   收藏
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    【目的】从前期转录组测序结果中筛选获得一个在霜霉威(propamocarb)胁迫条件下差异上调表达的基因CsWRKY30,对其进行克隆并分析其在霜霉威胁迫下的功能,了解黄瓜低霜霉威残留的分子机制。【方法】通过PCR技术扩增CsWRKY30全长,利用NCBI和PlantCARE在线工具分别进行该基因编码蛋白的保守结构域分析和启动子序列分析;利用实时荧光定量PCR分析CsWRKY30在霜霉威胁迫及其他胁迫条件下的相关表达模式;通过与GFP蛋白融合对CsWRKY30蛋白进行亚细胞定位;通过花序侵染法将CsWRKY30构建的植物过表达载体转化到哥伦比亚野生型拟南芥中,对获得的纯合转基因株系在霜霉威胁迫条件下的功能进行鉴定。【结果】CsWRKY30的CDS序列全长为1 014 bp,其编码的337个氨基酸中包含1个由60个氨基酸组成的WRKY结构域。CsWRKY30表达模式分析结果显示,黄瓜遭受霜霉威胁迫时,CsWRKY30在低霜霉威残留品系D0351中表达量显著上调,而在高霜霉威残留品系D9320中表达量并没有发生改变;在霜霉威胁迫的0.5—9 h间,该基因在D0351中的表达量一直明显高于对照,然而在24 h以后,该基因的表达不再显著上调。组织特异性表达分析表明,CsWRKY30主要在黄瓜果实中表达。蛋白亚细胞定位结果表明,CsWRKY30定位于细胞核。对CsWRKY30转基因拟南芥进行霜霉威胁迫发现,在未处理条件下,CsWRKY30 转基因拟南芥与野生型拟南芥表型上无明显差异;在2 mmol?L-1霜霉威处理条件下,CsWRKY30转基因拟南芥萌发率及主根长均明显高于野生型拟南芥。在其他逆境作用下,CsWRKY30对霜霉威和多主棒孢霉菌条件积极响应,对干旱和高盐没有作用,同时受到脱落酸(ABA)信号诱导。【结论】黄瓜CsWRKY30在霜霉威胁迫条件下发挥重要作用,过量表达CsWRKY30可显著提高转基因拟南芥对霜霉威胁迫的抵抗能力。
    苹果中4种常用农药残留及其膳食暴露评估
    叶孟亮,聂继云,徐国锋,闫 震,郑丽静
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1289-1302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.007
    摘要 ( 345 )   HTML ( 1 )   PDF (2511KB) ( 534 )   收藏
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    【目的】对国产苹果中多菌灵、甲基硫菌灵、吡虫啉和灭幼脲4种常用农药残留及其膳食暴露进行评估,明确并量化中国居民食用苹果途径的上述4种常用农药膳食摄入风险水平,为苹果安全生产、消费及质量安全监管提供依据。【方法】基于渤海湾(辽宁、山东、河北)和西北黄土高原(陕西、山西、河南)两大苹果优势主产区采集的282份苹果样品,运用专业风险评估软件@Risk,尝试构建非参数概率评估模型,对中国居民食用苹果途径的农药膳食摄入(暴露)风险进行概率评估。首先对282份苹果样品中上述4种农药残留检测值进行分布拟合,拟合度运用Chi-Squared、Anderson-Darling、Kolmogorov-Smirnov 3种统计方法进行检验,综合考虑3种评估拟合结果,确定最佳拟合分布。STMR、HR取最佳分布拟合值,%ADI和%ARfD分别表示慢性膳食摄入风险和急性膳食摄入风险。【结果】参试的282份苹果样品,255份(占90.4%)苹果样品中检出了农药残留。在检出的4种常用农药中,多菌灵的检出率最高,达到81.9%;其次为甲基硫菌灵和吡虫啉,分别为52.1%和39.0%;灭幼脲的检出率最低,仅为31.2%。绝大多数苹果样品中农药残留量处于较低水平,最大检出浓度为0.9251 mg·kg-1(多菌灵),但仍远低于最大残留限量值3.0 mg·kg-1。样品中4种常用农药残留量均值依次为多菌灵(0.1042 mg·kg-1)>灭幼脲(0.0182 mg·kg-1)>甲基硫菌灵(0.0082 mg·kg-1)>吡虫啉(0.0050 mg·kg-1)。样品中4种常用农药残留量离散程度有异,变异系数分别达到232.8%(甲基硫菌灵)、214.8%(吡虫啉)、174.1%(灭幼脲)和136.4%(多菌灵)。282份苹果样品农药残留量分布规律较明显,随着农药残留浓度的升高,样品所占的比例均呈逐渐降低的趋势。27份(占9.6%)苹果样品中未检出上述4种常用农药,198份(占70.2%)苹果样品中检出2种及以上农药残留,19份(占6.7%)苹果样品甚至检出4种农药残留。不同年龄组人群食用苹果途径的上述4种常用农药慢性膳食摄入风险(%ADI)分别为0.2120%—35.1100%(多菌灵)、0.0051%—0.8240%(吡虫啉)、0.0049%—0.1710%(甲基硫菌灵)和0.0004%—0.0152%(灭幼脲);急性膳食摄入风险(%ARfD)分别为0.1940%—16.0500%(多菌灵)和0.0122%—0.9400%(吡虫啉)。幼儿(2—6岁)和儿童(7—13岁)2个年龄组人群由于体重较轻,而苹果摄入量相对较高,膳食摄入风险明显高于其他年龄组人群,为重点监控对象。不同年龄组人群之间,随着年龄的增加,农药膳食摄入风险整体呈逐渐下降趋势;同一年龄组人群,选取的百分位点值越高,农药膳食摄入风险越大。【结论】中国苹果中多菌灵、甲基硫菌灵、吡虫啉和灭幼脲这4种常用农药检出率较高,但所有样品农药残留量均低于最大残留限量。中国居民食用苹果途径的上述4种常用农药慢性和急性膳食摄入风险均很低,幼儿和儿童2个年龄组人群膳食摄入风险明显高于其他年龄组人群,需重点关注。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    银川盆地净初级生产力估算和趋势分析
    李柏延,任志远
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1303-1314.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.008
    摘要 ( 255 )   HTML ( 1 )   PDF (5607KB) ( 252 )   收藏
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    【目的】基于2000—2010年间的遥感数据、气象数据,利用净初级生产力(NPP)估算模型模拟银川盆地NPP,分别从逐月、逐年对其时空变化过程进行分析,并进行预测分析,阐述11年期间银川盆地植被NPP的时空格局与变化特征,探讨NPP与植被健康指数(VHI)之间的耦合关系。【方法】选取2000—2010年间的SPOT VEGETATION数据、归一化植被指数(NDVI)、遥感数据、考虑了研究地区内及其周边气象站点数据等,利用CASA 模型,一元线性回归、奇异值分解等方法对银川盆地NPP空间分布进行估算与分析。【结果】2000—2010年,银川盆地逐月NPP平均值呈现小幅度增长,月均增加0.51 gC·m-2,以7月、10月NPP值增长最为显著;2000—2010年,银川盆地逐年NPP平均值也呈小幅度增长,年均增加0.24 gC·m-2,NPP 年平均值总体呈波动趋势,以2007、2009年NPP增长最为显著,降水直接导致了2005、2006年的NPP值出现低值;2000—2010年,从银川盆地NPP空间变化来看,行政区域年平均NPP物质量大小依次为:大武口区>永宁县>灵武市>西夏区>青铜峡市>利通区>平罗县>贺兰县>惠农区>兴庆区>金凤区。银川盆地NPP 平均值表现出“南北高中间低、东高西低”的空间格局,其中NPP低值集中在西夏区、兴庆区、金凤区等区域;NPP趋势的好坏与村镇点数量大小、人口数量呈异步变化关系;银川盆地的VHI变高(低)时,NPP随之变低(高),第一模态左右场的相关系数为-0.69,呈现异步耦合关系。【结论】采用光能利用模型对银川盆地的NPP进行估算模拟和实测验证,发现其模拟结果与实测数据接近,该模型测算银川盆地的NPP较为合理;银川盆地NPP总体趋于良好,但局部区域出现恶化情况;银川盆地NPP波动明显,主要受土壤湿度的影响,因此NPP对干旱具有一定的指示作用。
    不同品种小麦下土壤微生物量和可溶性有机物对不同施氮量的响应
    杨馨逸,刘小虎,韩晓日,段鹏鹏,朱玉翠,齐文
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1315-1324.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.009
    摘要 ( 330 )   HTML ( 1 )   PDF (378KB) ( 517 )   收藏
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    【目的】辽春10号和辽春18号小麦是常见的两个小麦品种,但是关于这两个小麦品种在不同施氮量下对维持土壤肥力的差异性方面还未知,因此探讨土壤中活性有机库(微生物量碳氮和土壤可溶性有机碳氮)在各生育期的动态变化,以此来评价土壤活性有机库对不同施氮量的响应以及转化。【方法】以不同品种盆栽小麦为研究对象,在不同施氮量(N0:0 kg·hm-2、N1:45 kg·hm-2、N2:90 kg·hm-2、N3:135 kg·hm-2、N4:180 kg·hm-2、N5:225 kg·hm-2)的设定下,探究土壤活性有机库在小麦生育期内的动态变化及相互关系。【结果】小麦生育期以及氮水平对土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮的含量有显著影响(P<0.01);除可溶性有机碳和有机碳外(P>0.05),小麦品种对土壤微生物量碳氮和可溶性有机氮均有显著影响(P<0.01)。施用氮肥能够显著提高土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮的含量(P<0.05),并且随施氮量的增加,土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮在N3处理达到最大,然后随施氮量的增加而降低,特别是在N5处理下,土壤可溶性有机碳氮的含量均低于不施氮肥处理(N0);与微生物量氮和可溶性有机碳相比,施用氮肥对土壤微生物量碳和土壤可溶性有机氮含量的增幅更大;土壤微生物量碳/土壤微生物量氮在N5处理下最大(平均值分别为13.28和11.45),而在N3处理下最低(平均值分别为7.94和7.83)。在小麦整个生育期内,土壤微生物量碳氮和可溶性有机碳氮含量均在开花期最大,其次为收获期、拔节期和分蘖期,苗期最小,总的来说,在各个时期土壤可溶性有机碳与微生物量碳以及土壤可溶性有机氮与微生物量氮之间均有着显著的正相关关系(P<0.01);两个不同品种小麦之间,其地上生物量均没有显著差异(P>0.05),但随施氮量的增加,呈先增加后降低的趋势,并且随小麦生育期而增加;而土壤有机碳和土壤全氮也在N3处理达到最大,并且随生育期而增加,在收获期达到最大。【结论】适宜氮量(N3)能够更好地协调土壤中微生物量碳氮和可溶性有机碳氮在小麦生育期内的转化及维持土壤生产力。
    园艺
    苹果bZIP转录因子家族生物信息学分析及其在休眠芽中的表达
    孙明岳,周 君,谭秋平,付喜玲,陈修德,李 玲,高东升
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1325-1345.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.010
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    【目的】鉴定苹果(Malus×domestica Borkh.)基因组上的bZIP基因(MdbZIP),为研究苹果bZIP转录因子提供相关信息以及在芽休眠过程中的调控作用提供理论参考。【方法】通过Pfam下载bZIP隐马尔科夫模型bZIP_1(PF00170)与bZIP_2(PF07716),利用HMMER 3.0鉴定苹果bZIP基因。使用Clustal Omega、MEGA6.0、MapInspect、DNAMAN 6.0和MEME4.10.2等软件对其蛋白序列进行生物信息学分析。采用Microarray分析与qRT-PCR技术检测苹果bZIP基因在不同处理下及其在高需冷量品种与低需冷量品种中的表达情况。【结果】鉴定得到120个苹果bZIP基因,与拟南芥的系统进化树分析将苹果bZIP分为10个亚家族(A—I和S)。染色体定位分析显示,109个苹果bZIP不均匀分布于17条染色体上,其中,11个基因无匹配的染色体定位。8号染色体上分布最多(13个),1号染色体分布最少(1个),一些染色体区域基因密度较高。基因结构分析表明,MdbZIP基因家族外显子数量0—23个,其中23个基因无内含子,分布于F亚家族(4)与S亚家族(19),基因结构进化高度保守。保守元件分析表明,MdbZIP基因家族包含30个保守元件:元件1为bZIP保守结构域;在D亚家族发现的元件10与G亚家族发现的14为已知元件,另外多数元件功能未知。通过Microarray分析显示,多个MdbZIP均可能与芽休眠的解除相关。qRT-PCR结果显示在不同品种中A亚家族8个MdbZIP均呈现出ABA诱导表达,而D亚家族中随着冷处理时间延长,在需冷量不同的品种中出现多种表达模式。【结论】苹果bZIP基因家族结构高度保守,在ABA与冷处理下呈现不同表达模式,可能参与调控苹果芽休眠进程。
    温州蜜柑果实贮藏寿命生物标记的筛选
    孙力,丁毓端,何义仲,陈玲玲,程运江
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1346-1359.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.011
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    【目的】对温州蜜柑果实贮藏期所处生理状态进行分析,挖掘能反映柑橘果实采后贮藏期所处不同生理阶段的生物标记。【方法】通过对温州蜜柑采后贮藏0—50 d的基因芯片数据和初生代谢物数据分析,结合聚类、主成分分析、偏最小二乘法判别分析和支持向量机等机器学习的方法挖掘能够预测温州蜜柑果实贮藏寿命的生物标记,并采用qRT-PCR对标记的可靠性进行验证。【结果】基于多元差异比较分析筛选出了5 232个差异基因;并将采后温州蜜柑分为贮藏初期、中期和后期3个生理阶段。Mapman功能富集分析发现氨基酸代谢和细胞壁代谢与采后温州蜜柑所处的生理状态密切相关;基因本体富集分析表明核小体组装、蛋白酶解等生物过程也发生了明显变化。qRT-PCR验证结果显示,谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)实时定量值具有明显的阶段性特征,可作为预测温州蜜柑采后贮藏寿命的基因标记。与芯片数据对应的初生代谢物数据同样可将温州蜜柑采后贮藏期划分为3个生理阶段,且筛选出甘氨酸(Glycine)、3-氨基-6-甲氧基吡啶甲酸(3-Amino-6-methoxypicolinicacid)、丁烯二酸(2-Butenedioic acid)、Cyclohexanone,2-[(dimethylamino)methyl]4个候选代谢物标记。【结论】筛选了5个生物标记物,包括谷胱甘肽S-转移酶、甘氨酸(Glycine)、3-氨基-6-甲氧基吡啶甲酸(3-Amino-6- methoxypicolinicacid)、丁烯二酸(2-Butenedioic acid)、Cyclohexanone, 2-[(dimethylamino)methyl],可以用来预测温州蜜柑果实贮藏寿命。
    贮藏·保鲜·加工
    蛋白质磷酸化调控羊肉肌原纤维蛋白的功能
    陈立娟,李 欣,李 铮,李培迪,李仲文,张德权
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1360-1370.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.012
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    【目的】通过激活蛋白激酶的活性提高羊肉肌原纤维蛋白的磷酸化水平,分析磷酸化水平的提高对羊肉肌原纤维蛋白降解程度、收缩功能的影响,进一步揭示蛋白质磷酸化对羊肉肌肉嫩化的作用机理。【方法】通过添加蛋白激酶A激活剂Forskolin、蛋白激酶C激活剂佛波酯(PMA),提高蛋白激酶的活性,改变羊肉肌原纤维蛋白的磷酸化水平。比较激活剂处理组与空白对照组肌原纤维小片化指数(MFI)、条带降解程度、肌节长度等指标的差异,确定蛋白质磷酸化水平对羊肉肌肉收缩和肌肉降解的影响。【结果】将羊肉样品在蛋白激酶溶液中培养24 h,在培养结束后1、2和4 h,PMA处理组(PKC激活组)的蛋白激酶活性显著高于空白对照组(P<0.05),而在培养后1和4 h,Forskolin处理组(PKA激活组)的蛋白激酶活性显著高于空白对照组(P<0.05)。PMA处理组和Forskolin处理组的最高蛋白激酶活性出现在培养后1 h。Forskolin和PMA通过提高激酶活性显著提高肌联蛋白(Titin)、肌球蛋白结合蛋白C(Myosin binding protein C)、原肌球蛋白(Tropomyosin)、肌球蛋白轻链2(Myosin light chain 2)等蛋白质的磷酸化水平,肌球蛋白重链、肌动蛋白质的磷酸化水平没有显著变化,Forskolin组和PMA组的蛋白质降解程度及肌节长度均低于对照组。【结论】肌原纤维蛋白磷酸化水平提高不利于羊肉肌原纤维蛋白的降解。另一方面,磷酸化水平可能通过对肌球蛋白轻链2的作用增强羊肉肌肉的收缩作用力,通过促进相邻原肌球蛋白的相互作用促进肌细丝收缩,影响肉的僵直进程和嫩化进程。
    淮稻5号的真菌多样性及其储藏过程中可培养的优势真菌
    都立辉,和肖营,刘凌平,袁 建,鞠兴荣
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1371-1381.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.013
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    【目的】从传统形态学和分子生物学两方面对2013年的淮稻5号中分离的真菌进行鉴定,并研究淮稻5号在不同储藏条件下优势菌株的演变规律,为该品种稻谷储藏过程中的真菌种属研究及霉变防控提供参考。【方法】淮稻5号中的可培养真菌通过采用孟加拉红和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)两种培养基,按照国标GB 4789.15—2010的操作获得。将采自4个不同地区的淮稻5号混匀,分别调节其水分含量为14.5%和18.5%后放入25℃人工气候箱内模拟储藏,逐月取出模拟储藏的稻谷样品进行传统培养以确定可培养的优势真菌。真菌的种属分别通过菌落、菌丝及孢子的形态学观察,对照《中国真菌志》等参考文献确定;同时通过PCR分别扩增相应真菌的内转录间隔区(ITS)和28S rDNA的部分序列,连接T载体后测序,通过构建系统发育树进而确定真菌的种属。【结果】从4个地区的2013年淮稻5号稻谷中共分离得到33株真菌,主要为青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)和镰刀菌(Fusarium)等菌属,其中青霉属与曲霉属最多,分别为16株和15株,分别占分离所得菌株的48.5%和45.5%,表明青霉和曲霉是2013年淮稻5号稻谷中可培养真菌的优势菌属。而镰刀菌属的真菌仅2株,仅占分离所得菌株的6%。模拟储藏的结果表明,水分含量为14.5%的淮稻5号在25℃条件下储藏6个月时出现优势菌株,为橘灰青霉(Penicillium aurantiogriseum),并且该优势菌在模拟储藏的第7、8个月持续存在。水分含量为18.5%的淮稻5号在25℃条件下储藏7个月时出现优势菌株,为酵母菌,且该优势菌在模拟储藏8个月时依然存在。【结论】2013年淮稻5号中分离获得33株真菌,主要包括16株青霉、15株曲霉以及2株镰刀菌,表明青霉和曲霉是2013年淮稻5号稻谷中的优势菌属。不同水分含量的稻谷在储藏过程中可能出现不同的优势菌株。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    两种饲养方式下仔猪生产性能、行为和唾液皮质醇水平的对比分析
    朱洪龙,杨杰,李健,潘孝青,秦枫,周忠凯,冯国兴,顾洪如
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1382-1390.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.014
    摘要 ( 258 )   HTML ( 2 )   PDF (395KB) ( 370 )   收藏
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    【目的】在两种不同饲养方式下,对断奶仔猪生产性能、行为特征和唾液皮质醇激素水平作对比分析,以期说明发酵床饲养可提高仔猪动物福利。【方法】按照密度一致原则 (0.67 m2/头),将88头体重相近(10.42±0.36 kg)的35日龄断奶苏钟仔猪(公母各半)随机分为两组,即漏缝地板饲养组(slatted-floor house, SFH)和发酵床饲养组 (deep-litter house, DLH)。每组设4个重复,SFH和DLH组中每个重复分别为6和16头。适应14 d后,进入试验期,试验期为21 d。自由采食和饮水。试验期间记录仔猪日采食量,分别于仔猪49日龄和70日龄时进行个体称重,按重复计算仔猪的日增重和料肉比;于仔猪68日龄时,进行24 h录像采集,每个重复随机挑选3头仔猪用于行为学观察,观察时间为07:00-17:00;于69日龄上午9:00-10:00,每个重复选择3头仔猪用于唾液采集,测定其皮质醇激素含量。【结果】①SFH和DLH组仔猪末重、日均采食量、日增重和料肉比均无显著差异(P>0.05)。②与SFH组相比,DLH组仔猪站立和犬坐行为时间比例显著增加(P<0.05),躺卧行为显著降低(P<0.05);仔猪主要活动时间为08:00-10:00和12:00-15:00;DLH组中仔猪运动和探究行为(特别是翻拱垫料行为)时间比例显著高于SFH组(P<0.05),操纵圈舍行为和攻击行为显著低于SFH组(P<0.05);与SFH组相比,DLH显著提高了仔猪饮水时间比例(P<0.05),但对排泄(排尿和排便)行为无显著影响(P>0.05);DLH组仔猪总采食时间显著低于SFH组(P<0.05),但因采食次数的显著增加(P<0.05),使DLH组仔猪每次采食持续时间显著高于SFH组(P<0.05)。③DLH组仔猪唾液中皮质醇激素含量显著高于SFH组(P<0.05)。【结论】发酵床饲养能够增加断奶仔猪的探究行为、运动行为以及每次采食持续时间,降低其攻击和操纵圈舍行为,提高了仔猪动物福利。
    乌珠穆沁绵羊RIPK2基因多态性与生长性状的关联
    马晓萌,轩俊丽,王慧华,袁泽湖,吴明明,朱才业,刘瑞凿,魏彩虹,赵福平,杜立新,张莉
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1391-1407.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.015
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    【目的】基于前期绵羊肉用性状GWAS研究结果,旨在探讨RIPK2基因对乌珠穆沁绵羊生长性状的影响,找到该基因中与绵羊生长性状相关的分子标记,同时对GWAS结果进行验证。【方法】在343只乌珠穆沁绵羊试验群体中,选取其中30个个体的血液DNA样本,以相同浓度组成池DNA,设计引物对RIPK2基因外显子及其上下游1 000bp的调控区进行PCR扩增,PCR产物检测为目的条带后测序。使用DNAMAN和Chromas2软件对测序峰图进行分析,采用飞行质谱方法对检测到的SNP位点及前期GWAS得到的SNP位点进行基因型分型。使用Haploview软件对多态位点构建单倍型及连锁不平衡分析。使用SPSS (22.0)软件进行RIPK2基因SNP位点与生长性状间的关联分析。【结果】共发现了4个多态位点,A5536G的同义突变rs01位于第四外显子内,在该位点检测到三种基因型,AA基因型频率为0.42,AG基因型频率为0.45,GG基因型频率为0.13,优势等位基因为A,其频率为0.65;在第七外显子上检测到T8952C错义突变rs02,在该突变位点检测到3种基因型,其中TT基因型频率为0.82,TC基因型频率为0.16,CC基因型频率为0.02,T为优势等位基因,基因频率为0.9;在第十外显子检测到 T2836C的突变rs05,在该位点检测到两种基因型TT和CC,没有检测到杂合子基因型,TT基因型频率为0.25,CC基因型频率为0.75;上游调控区发现一个G5181C的突变rs30,有3种基因型,其中GC基因型频率为0.50,CC基因型频率为0.18,GG基因型频率为0.32,G为优势等位基因,其频率为0.58; GWAS得到的SNP位点是T4456C,在本研究中被命名为rs34,在该位点有3种基因型,其中TT基因型频率为0.49,TC基因型频率为0.37,CC基因型频率为0.14,优势等位基因T的频率为0.68。χ2适合性检验发现,除rs34位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。rs02位点处于低度多态(PIC<0.25),其余位点处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。连锁不平衡分析发现,rs01和rs02位点强连锁,在群体中共构建了3种单倍型,AT 为优势单倍型,其频率为0.645,这两个位点共构建了6 种基因型组合,其中AATT为优势基因型组合,频率为0.425。单标记关联分析表明:rs01位点的AA、AG基因型的个体和GG基因型个体在4月龄体重、胸围上差异显著(P<0.05),在6月龄体高、胸围上差异显著(P<0.05)。rs02位点CC基因型个体在4月龄体重、体高、胸围和6月龄胸宽上显著优于TT、TC基因型个体(P<0.05),在4月龄体斜长、6月龄体高和体斜长上极显著优于TT、TC基因型的个体(P<0.01)。rs30位点上,GG基因型的个体在4月龄体重、胸围与其他两种基因型个差异显著(P<0.05),3个基因型的个体在6月龄胸围上均有显著差异(P<0.05)。rs34位点的3个基因型的个体仅在4月龄体重上差异显著(P<0.05)。rs01-rs02组合基因型关联分析发现:GGCC基因型组合的个体在4月龄体重、体高、体斜长、胸围上与其他基因型之间差异显著(P<0.05),GGCC基因型组合的个体在6月龄体高、体斜长、胸宽上与其他基因型组合的个体差异显著(P<0.05)。【结论】RIPK2基因对绵羊生长性状具有较显著的影响,其SNPs作为分子标记对乌珠穆沁绵羊生长性状的选育具有一定的指导意义。
    新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用
    张帆帆,宋德平,周信荣,黄冬艳,李安琪,彭 棋,陈燕君,吴 琼,何后军,唐玉新
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1408-1416.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.016
    摘要 ( 367 )   HTML ( 1 )   PDF (721KB) ( 542 )   收藏
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    【目的】猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳(N)蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒(PKoV)、猪星状病毒(PAstV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012—2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×106拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×101拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×103拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%(78/249),母猪粪便中PDCoV的检出率(27.78%)稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率(31.92%),最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。
    研究简报
    苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(PEPCKs)的克隆与表达分析
    李慧峰,冉昆,程来亮,王海波,何平,常源升,李林光
    中国农业科学. 2016, 49(7):  1417-1428.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.07.017
    摘要 ( 252 )   HTML ( 1 )   PDF (3111KB) ( 542 )   收藏
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    【目的】克隆苹果(Malus×domestica Borkh.)多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、模拟干旱(PEG)、高温(40℃)和低温(8℃)处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(MdPCK1MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965),其开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,MdPCK1MdPCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100 μmol·L-1 ABA和100 g·L-1 PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150 μmol·L-1 SA、100 μmol·L-1 ABA、100 g·L-1 PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1MdPCK2表达。