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当期目录

    2015年 第48卷 第15期 刊出日期:2015-08-01
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    基于关联分析的新陆早棉花品种农艺和纤维品质性状优异等位基因挖掘
    聂新辉,尤春源,鲍健,李晓方,惠慧,刘洪亮,秦江鸿,林忠旭
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2891-2910.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.001
    摘要 ( 538 )   HTML ( 1 )   PDF (3343KB) ( 674 )   收藏
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    【目的】寻找与新陆早棉花品种农艺和纤维品质性状相关联的分子标记,鉴别与这些性状相关的优异等位变异及携带优异等位变异基因的典型载体材料,为新陆早棉花品种分子设计育种奠定基础。【方法】利用筛选出分布于26条染色体且多态性高的75对SSR标记对51份新陆早棉花品种进行多态性扫描;采用R语言编程软件对多环境的表型性状绘制boxplot图;在对供试材料进行群体结构和连锁不平衡分析的基础上,利用TASSEL软件中MLM(mixed linear model)方法进行分子标记与15个性状的关联分析;依据计算的表型效应值,鉴别和统计优异等位变异的位点及典型材料。【结果】通过群体遗传结构分析将51份新陆早棉花品种划分为4个亚群结构。针对15个表现型性状的BLUP(best linear unbiased prediction)结果进行统计和分析,鉴别出极显著和显著相关的性状。分析结果显示,在4种环境条件下,棉花5个性状(果枝始节高、果枝始节数、衣分、纤维上半部长度和短纤维率)变化趋势稳定,10个性状(株高、果枝数、叶枝数、有效铃数、单铃籽棉重、单铃皮棉重、马克隆值、比强度、纤维整齐度和纤维伸长率)较稳定。通过关联分析,获得与农艺性状相关的等位变异位点117个(P<0.05),其中对9个农艺性状贡献率(R2)最大的等位变异位点分别为:BNL3650b(株高,R2=11.78;果枝始节高,R2=20.80;果枝始节数,R2=11.54)、NAU3995c(果枝数,R2=14.86)、BNL119b(叶枝数,R2=9.7)、NAU3995d(有效铃数,R2=14.98)、BNL3255a (单铃籽棉重,R2=11.11)、NAU1071a(单铃皮棉重,R2=10.15)和BNL663a(衣分,R2=12.42)。与纤维品质相关的等位变异位点55个(P<0.05),其中分别对6个纤维品质性状贡献率最大的等位变异位点为:NAU1103b(纤维上半部长度,R2=6.4)、NAU1071a(纤维比强度,R2=7.57)、BNL3140b(马克隆值,R2=12.06)、BNL3650b(纤维整齐度,R2=13.47)、BNL1421a(短纤维率,R2=13.04)和BNL2960b(纤维伸长率,R2=11.67)。共检测到39个与农艺(29个)和纤维品质(10个)性状相关的位点(P<0.01),对表型变异解释率范围为6.45%—20.8%,平均值为11.14%,同时检测到与2个以上性状相关联的位点47个。携带优异等位变异基因的典型材料共计17份。通过与已经报道的棉花农艺和纤维品质性状相关的QTL(quantitative trait loci)比较,检测的27个QTL在前人研究中已经报道,其中BNL3650(纤维整齐度)、BNL3033(马克隆值)、NAU3254(纤维伸长率)、GH132(衣分)、TMB1618(比强度)、BNL1421(比强度和纤维整齐度)和BNL119(纤维伸长率)7个QTL具有相同的关联性状。【结论】51份原种新陆早棉花品种的群体遗传结构简单,连锁不平衡水平低,表型性状在2种环境条件下变化趋势较稳定。基于SSR的关联分析,发掘了一些与农艺和纤维品质相关的优异等位变异基因及典型材料。
    MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成
    贾小云,刘慧,沈洁,李芳,丁娜,孙岩,高昌勇,李润植
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2911-2924.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.002
    摘要 ( 393 )   HTML ( 1 )   PDF (4743KB) ( 682 )   收藏
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    【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能,特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄(AC)中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料,设置正常供磷(+Pi,MS+KH2PO4 3.4 g·L-1)和缺磷(-Pi,MS+KCl 1.86 g·L-1)2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后,观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异,通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like(SGN-U320618)和花青素合成相关酶基因(PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H)的表达模式,应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用,且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间,从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高,在LA1996中的表达最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高,在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反,证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下,野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高;miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%—60%,花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下,野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达;转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄;转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅;转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株;miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下,miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达,进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。
    紫花苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析
    申玉华,徐振军,唐立红,杨晓坡,黄文婕,武小斌,张文波
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2925-2938.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.003
    摘要 ( 436 )   HTML ( 1 )   PDF (4153KB) ( 608 )   收藏
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    【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因MsNAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿MsNAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建MsNAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建pBI121-MsNAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达MsNAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】MsNAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙CsNAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明MsNAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsNAC2受250 mmol·L-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且MsNAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在NaCl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L-1 NaCl、20% PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因MsNAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达MsNAC2烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    施氮量对春谷农艺性状、光合特性和产量的影响
    张艾英,郭二虎,王军,范惠萍,李瑜辉,王丽霞,王秀清,程丽萍
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2939-2951.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.004
    摘要 ( 463 )   HTML ( 1 )   PDF (1138KB) ( 743 )   收藏
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    【目的】通过分析不同氮素水平下春谷品种农艺性状、光合特性与产量的变化规律,确定春谷最佳施氮量,并探讨光合特性与产量相关性。【方法】以春谷品种长农35号和晋谷21号为试验材料,采用裂区设计,品种为主区、施氮量为副区,重复3次,小区面积15.0 m2(5 m×3 m),留苗30万株/hm2。共设0(N1)、45(N2)、90(N3)、135(N4)、180(N5)和 225 kg·hm-2(N6)6个氮素水平,40%氮肥作底施,60%在拔节至孕穗期追施。于谷子抽穗后,用日本产叶绿素测定仪SPAD-502(Konica Minolta)测定顶三叶SPAD值,用美国产CIRAS-2光合速率仪(PPSYSTEMS)测定谷子顶三叶的细胞间隙二氧化碳浓度(Ci)、光合速率(Pn)和蒸腾速率(E)。【结果】随着氮素水平的提高,春谷品种的株高、茎粗、穗长呈上升趋势,穗重、穗粒重、旗叶与顶三叶SPAD值、蒸腾速率(E)及光合速率(Pn)表现为先升高后降低,千粒重在各氮素处理间无显著差异,氮水平为90 kg·hm-2 时,以上各指标值(千粒重除外)达到或接近最大,产量趋于稳定,预示氮肥施用量90 kg·hm-2 为春谷最佳施氮量,进一步通过2个春谷品种产量随氮素施用量变化回归方程计算出最高理论产量,方差分析表明两品种最高理论产量和施氮90 kg·hm-2 时产量无显著差异(P长农35号=0.5571、P晋谷21号=0.6632)。综合以上结果,将90 kg·hm-2 施氮量确定为春谷最佳施氮量。春谷光合生理指标与产量相关性分析表明:谷子旗叶蒸腾速率(E)及光合速率(Pn)与产量相关系数分别为 0.87和0.86,顶三叶总蒸腾速率(E)及总光合速率(Pn)与产量相关系数分别为 0.82和0.83,4个相关系数值均达到显著水平。【结论】明确了春谷品种在山西中南部生态气候和土壤条件下的最佳施氮量为90 kg·hm-2,发现谷子开花后旗叶蒸腾速率(E)及光合速率(Pn)、顶三叶蒸腾速率(E)及光合速率(Pn)与春谷产量呈显著正相关。
    中国冬油菜栽培方式变迁与相应的养分管理策略
    王寅,鲁剑巍
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2952-2966.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.005
    摘要 ( 294 )   HTML ( 1 )   PDF (1688KB) ( 411 )   收藏
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    直播和育苗移栽是目前长江流域冬油菜并存的两种栽培方式,其技术发展和推广状况对中国油菜产业发展和油料供应安全具有重要意义。不同的历史阶段下,随栽培品种、种植目标、劳动力条件和生产力水平等因素的变化,中国冬油菜栽培方式也在不断的转变和发展。文章概述了新中国建立后冬油菜栽培方式的发展变化历程,从最初以直播种植为主,到20世纪60年代中期直播为主而育苗移栽开始起步,20世纪80年代育苗移栽方式实现全面推广并长期应用,再到当前直播和育苗移栽两种栽培方式并存。而养分管理措施也经历了从最初施用农家肥,到开始施用氮、磷化肥,到提倡氮、磷、钾、硼肥配合施用,再到当前形成的育苗移栽油菜高产高效养分管理技术。直播和育苗移栽油菜的栽培特点和生长过程存在着显著差异,文章主要从生育进程、种植密度、群体结构与个体形态等方面对两者进行了分析和比较。相比育苗移栽油菜,直播油菜的生育期一般相应缩短,个体生长状况较弱,单株产量偏低,但在较高的种植密度基础上可发挥群体优势,且根群结构也有助于增强养分和水分吸收能力,因此具有高产高效的潜力。目前,长江流域育苗移栽油菜的养分丰缺指标和推荐施肥体系已经建立,养分管理策略也较为完善,其要点为:根据土壤肥力状况和目标产量水平合理确定氮、磷、钾、硼肥用量,保证养分平衡供应,实行有机无机肥料配合施用,采取氮、钾肥分次施用(推荐基肥﹕越冬肥﹕薹肥=60%﹕20%﹕20%)以协调生长发育和养分吸收,强壮个体而实现高产。针对直播油菜发展迅速而在高产条件下养分管理研究相对滞后的现状,文章重点比较了其与育苗移栽油菜在养分响应、吸收分配和需求利用等方面的差异,发现直播油菜对养分缺乏较为敏感,养分不足导致个体生长低下和群体衰亡,后期物质和养分转运效率较低,而且对磷、钾养分的需求明显更高。基于已有研究结果总结出直播油菜的“前促后稳”养分管理策略,即在氮、磷、钾及微量元素养分合理平衡施用基础上,保证磷、钾供应,施用有机肥并进行秸秆还田,肥料运筹中重视氮肥对个体和群体发展的调控作用,减少基施而增加苗肥以促前期生长,中后期适时追肥以保证群体数量和产量形成,推荐基肥﹕苗肥﹕越冬肥﹕薹肥=40%﹕30%﹕15%﹕15%。此外,应配合其他栽培措施协同增效提质,选用适宜早熟和耐密的品种,采用机械化精量播种技术,施用长效专用复合肥或专用控释肥,配合密植以省肥补迟、增库促源,加强病虫草害防控技术。文章还对直播油菜养分管理研究中的问题和未来方向进行了探讨和展望,以期为进一步完善其栽培管理措施和科学施肥技术提供参考。
    植物保护
    中国冬小麦区域试验品种抗病性评价
    刘太国,邱军,周益林,徐世昌,陈怀谷,刘艳,高利,刘博,郑传临,陈万权
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2967-2975.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.006
    摘要 ( 393 )   HTML ( 1 )   PDF (413KB) ( 566 )   收藏
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    【目的】明确中国小麦主要后备品种和高代品系对条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病、黄矮病的抗性程度和水平,为培育抗病新品种、品种审定与推广、抗病品种合理布局、降低品种抗性“丧失”风险提供依据。【方法】以中国小麦条锈菌流行小种条中32(CYR32)、条中33号(CYR33)等、叶锈菌PHT、THT等、秆锈菌21C3、34C2等、对15个已知抗白粉病基因具有毒性的白粉菌混合菌系、赤霉病菌、纹枯病菌强毒力菌株和BYDV-GAV株系对1999—2014年度国家小麦区域试验品种(系)1 815份次试验材料进行成株期人工接种抗性鉴定,重要材料连续进行两年试验,以确保结果的重复和可靠。【结果】在所鉴定的品系中,具有3种抗病性以上的品种(系)共250个,通过农业部国家农作物品种审定委员会审定的品种共310个;中抗和高抗条锈病品种占参试品种的(39.8±21.7)%、中感和高感品种占(39.7±27.9)%;赤霉病、纹枯病、秆锈病和白粉病抗病品种所占比例分别为(31.5±27.5)%、(31.1±35.6)%、(48.2±25.6)%和(25.0±14.6)%、感病品种分别占(68.5±27.5)%、(62.2±38.6)%、(31.3±20.7)%和(70.7±14.6)%;抗叶锈病品种比例仅为(9.9±3.8)%,感病品种高达(70.4±15.1)%;除河农831表现中抗外,所有品种对黄矮病均表现感病,未出现高抗品种。【结论】抗源缺乏的病害未鉴定出抗性强的品种,抗条锈病和白粉病品种主要出现在甘肃、四川等地,抗叶锈小麦品种(系)较少。
    褐飞虱Yellow基因的克隆及功能
    王博,姚云,徐泽炜,林欣大
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2976-2984.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.007
    摘要 ( 300 )   HTML ( 5 )   PDF (5409KB) ( 14565 )   收藏
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    【目的】克隆褐飞虱(Nilaparvata lugens)Yellow基因(NlYellow),研究该基因在褐飞虱不同发育时期和不同组织中的表达谱,通过RNA干扰沉默NlYellow了解其功能。【方法】使用网络版primer3设计引物克隆NlYellow,将得到的cDNA序列翻译为氨基酸序列后,与GenBank数据库中其他物种的Yellow序列进行同源比对,并构建系统发育树。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,研究褐飞虱胚胎、1-5龄若虫以及成虫期NlYellow的相对表达量,并检测该基因在雌、雄成虫头、胸、腹、足、翅、卵巢和睾丸等组织中的相对表达量。向褐飞虱5龄若虫体内注射0.4 µg针对NlYellow的双链RNA,待羽化为成虫后观察表型。【结果】克隆得到NlYellowORF序列,通过序列比对发现它与豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)Yellow的氨基酸序列同源性最高(98%),但与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyx mori)等物种的氨基酸序列同源性较低。系统发育树分析显示它与豌豆蚜的亲缘关系最近。qRT-PCR显示NlYellow在胚胎期表达水平具有波动性,其中第1、3、4和5天中的表达量低于其他时段的表达量。此外,NlYellow在3龄和5龄若虫期表达量高于其他若虫期(P<0.05);该基因在雄虫头、胸、翅、足、中肠和睾丸中均有表达,但前4个组织中表达量相对较高(P<0.05);而在雌虫中,该基因只在头、胸、翅、足中表达。另外,该基因在短翅成虫中表达水平显著高于长翅成虫(P<0.05),并且在短翅成虫当中,雄虫中的表达量高于雌虫并达到显著水平(P<0.05)。采用RNA干扰技术沉默NlYellow后,褐飞虱成虫整体体色变黄,胸、腹和足颜色变化尤其明显。【结论】初步推测NlYellow的功能是参与外表皮色素沉积,改变体色。
    防治蓟马的球孢白僵菌SDDZ-9菌株液体发酵工艺优化
    张璐璐,吴圣勇,王帅宇,李娟,雷仲仁
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2985-2994.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.008
    摘要 ( 305 )   HTML ( 1 )   PDF (2728KB) ( 423 )   收藏
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    【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种重要的虫生真菌,已广泛应用于害虫生物防治,但其不成熟的规模化生产技术一直是限制球孢白僵菌广泛应用的主要问题之一。开展球孢白僵菌液体发酵工艺研究,提高液体发酵生物量,从而为固体发酵阶段提供优质的种子液,进而提高固体发酵的产孢量,为球孢白僵菌规模化生产提供参考。【方法】影响球孢白僵菌液体发酵的培养条件有温度、装样量、摇床转速、接种浓度和pH等,首先采用Plackett-Burman试验设计,筛选出影响球孢白僵菌菌株SDDZ-9的液体发酵的主要因子,然后运用最陡爬坡路径法,以试验值变化的梯度方向和各因素效应值的大小分别确定爬坡方向和变化步长,确定响应面的中心点,逼近最佳值区域,最后采用central composite design (CCD)响应曲面法,建立多元二次回归方程来拟合各因素与效应值之间的关系,并对影响发酵生物量的各因素及其交互作用进行响应面分析和评价,确定对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力较高的球孢白僵菌菌株SDDZ-9液体发酵的最优培养条件。【结果】培养温度、装样量、转速和浓度是影响发酵生物量的主要因子,一定范围内的pH变化对此菌株的液体发酵影响较小。在自然pH下,当培养温度27.08℃、装样49.72 mL(250 mL三角瓶)、摇床转速205.45 r/min、接种浓度1.122×107孢子/mL时,发酵48 h产生的生物量最大。在优化发酵条件下进行液固双相发酵试验,得到的球孢白僵菌液体发酵生物量为14.769 g·L-1,与模型预测生物量相符,固体发酵后产孢量为20.16 g·kg-1,含孢量1.84×1011孢子/g。【结论】在优化发酵工艺条件下进行发酵,可显著提高球孢白僵菌的产孢量,此液体发酵工艺为球孢白僵菌的规模化生产奠定了基础。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    基于Meta-Analysis研究施肥对中国农田土壤有机碳及其组分的影响
    蔡岸冬,张文菊,杨品品,韩天富,徐明岗
    中国农业科学. 2015, 48(15):  2995-3004.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.009
    摘要 ( 337 )   HTML ( 1 )   PDF (418KB) ( 710 )   收藏
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    【目的】施肥是影响农田土壤有机碳至关重要的因素之一。探讨施肥对不同利用类型与种植制度下土壤有机碳的影响程度,对于深刻认识农田土壤有机碳及其可持续管理均具有重要意义。【方法】收集已公开发表文献数据,建立具备相同有机碳分组方法但相对独立的286组数据库。采用数据整合分析方法(Meta-analysis),定量分析种植制度、利用类型等人为管理及土壤属性(质地)等因素下施肥(化肥和有机肥)对土壤总有机碳及矿物结合态组分含量的影响程度。【结果】与不施肥相比,施肥均能显著提高土壤总有机碳和矿物结合态组分的含量,其提高的幅度分别为39.4%和27.7%;且施用(增施或配施)有机肥对土壤总有机碳及矿物结合态组分的提高幅度(58.4%和41.9%)是化肥(13.4%和8.0%)的3.4倍和5.2倍。不同种植制度、利用类型和土壤质地条件下,施用化肥和有机肥对土壤总有机碳和矿物结合态组分的影响程度存在显著差异。一年一熟下,施用有机肥对土壤总有机碳的提高幅度(58.5%)显著高于一年两熟制(55.6%),施用化肥对矿物结合态组分含量的提高幅度(10.7%)也显著高于一年两熟(7.3%);但两种种植制度下施用有机肥对矿物结合态组分含量的提高幅度基本相当(42.6%—43.5%)。不同利用类型下,施肥能显著提高旱地土壤总有机碳及矿物结合态组分,且提高的幅度均高于水田;但施用化肥并没有显著提高水田中土壤总有机碳和矿物结合态含量。不同土壤质地条件下,施用有机肥能使土壤总有机碳水平较低的砂土提高64.4%,显著高于土壤有机碳水平较高的壤土和黏土(48.7%和50.3%);施用化肥使矿物结合态组分含量较低的砂土提高15.6%,其提高的幅度均显著高于矿物结合态组分含量较高的壤土和黏土(7.8%和8.1%)。【结论】有机肥的施用(增施或配施),尤其在一年一熟及有机碳水平较低的砂土上,对于农田土壤有机碳积累及肥力维持与提升均具有重要意义。
    不同施肥制度下中国东部典型土壤易分解与耐分解氮的组分特征
    于维水,卢昌艾,李桂花,武红亮,赵雅雯,王碧胜,孟繁华
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3005-3014.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.010
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    【目的】土壤易分解氮(labile nitrogen,Lab-N)和耐分解氮(recalcitrant nitrogen,Rec-N)是土壤氮库的两个重要组分,其组分含量与比例可反映土壤有机氮周转与固存特性。因此,研究土壤长期不同施肥制度下易分解氮与耐分解氮的含量及比例特性,是土壤氮库管理与土壤肥力质量建设的重要研究内容。【方法】利用中国东部3种旱作土样(吉林公主岭黑土、河南郑州潮土、湖南祁阳红壤)和1种水稻土土样(湖南望城),运用颗粒密度分组法,研究长期不施肥(CK)、施化肥(NPK)、化肥配施秸秆(NPKS)和化肥配施有机肥(NPKM)4种不同施肥制度下易分解氮和耐分解氮的含量及比例变化特征。【结果】旱作土壤易分解氮的平均含量为0.15 g·kg-1(0.10—0.29 g·kg-1)低于水田的0.22 g·kg-1(0.20—0.23 g·kg-1),而其占全氮的比例高于水田。经23年处理后,旱作土壤CK处理全氮含量较试验初期氮含量显著下降,下降的比例为7.5%—9.7%,水稻土则显著上升,升高的比例为11.5%;长期NPK处理,旱作土壤和水田全氮含量较CK显著增加,红壤易分解氮含量较CK易分解氮显著下降,其他地点无显著变化;长期NPKS处理,旱作和水田土壤全氮含量显著增加,黑土和水稻土易分解氮含量及其占全氮的比例较CK无显著变化,红壤易分解氮含量显著下降,而潮土易分解氮含量显著增加;长期NPKM处理,显著提高了旱作土壤全氮含量、易分解氮含量及易分解氮占全氮的比例,其中黑土增加的比例最大分别为85.0%、106.0%和4.2%,水稻土易分解氮含量及其占全氮的比例无显著差异性。4种土壤耐分解氮的含量与全氮含量的变化趋势一致,均表现为NPKM>NPKS>NPK>CK,其中NPKM处理降低了耐分解氮占全氮的比例。【结论】旱作土壤易分解氮含量及其占全氮的比例对不同施肥处理的响应比水田更加敏感。化肥配施有机肥处理显著提高了旱作土壤全氮含量、易分解氮含量及其占全氮的比例,效果优于秸秆还田,更优于化肥处理。
    园艺
    中国主要落叶果树果实硒含量及其膳食暴露评估
    聂继云,匡立学,李志霞,庞荣丽,杨莲,陈秋生,李安,赵旭博,徐维华
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3015-3026.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.011
    摘要 ( 227 )   HTML ( 1 )   PDF (495KB) ( 444 )   收藏
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    【目的】针对苹果、梨、桃、葡萄、枣、猕猴桃等6种主要国产落叶果树开展果实硒含量及其膳食暴露评估研究,明确硒含量水平及其对消费者健康的风险水平,为水果生产和消费提供参考。【方法】从主产区(包括安徽、河北、河南、江苏、辽宁、山东、陕西和新疆)共采集760个水果样品,采用氢化物原子荧光光谱法测定样品硒含量。分别以硒耐受上限(UTL)、硒最高用量(UIL)和硒适宜膳食摄入量(AI)为评价标准,对中国成人和哺乳妇女每日从6种水果中摄入硒的量(包括平均摄入量、最高摄入量、中间摄入量和最低摄入量)进行风险评估。【结果】 ⑴ 测定的760个水果样品,平均硒含量为4.3 μg·kg-1,最高硒含量为38.0 μg·kg-1,硒含量<5 μg·kg-1的样品占78.2%,富硒(硒含量≥10 μg·kg-1)样品占14.2%;⑵ 样品间硒含量有异,变异系数分别达到80.0%(枣)、110.0%(葡萄)、116.8%(梨)、125.7%(猕猴桃)、126.0%(苹果)、148.2%(桃)和136.5%(总体);⑶硒平均含量依次为枣(7.3 μg·kg-1)>葡萄(6.4 μg·kg-1)>桃(5.5 μg·kg-1)>猕猴桃(5.3 μg·kg-1)>梨(4.7 μg·kg-1)>苹果(1.3 μg·kg-1);⑷ 陕西的梨和桃以及陕西和新疆的葡萄,其硒含量均明显高于其他省份同类水果;⑸ 中国居民来自6种水果的硒平均摄入量分别为0.032 μg·d-1(猕猴桃)、0.120 μg·d-1(苹果)、0.183 μg·d-1(葡萄)、0.197 μg·d-1(枣)、0.213 μg·d-1(桃)、0.222 μg·d-1(梨)和0.968 μg·d-1(总体);⑹ 风险评估结果显示,中国居民从6种水果中摄入硒的量是安全的,风险指数均低于100%,为0.001%—99.702%(成人)和0.001%—31.847%(哺乳妇女)。【结论】中国6种主要落叶水果的硒含量均普遍较低,富硒产品比例均不高。枣硒含量最高,苹果硒含量最低,其他4种水果之间硒含量差异不明显。有的省份之间水果硒含量存在明显差异。哺乳妇女来自6种水果的硒摄入风险均较成人低。中国居民从6种水果中摄入硒的量是安全的,不会影响人体健康。生产富硒水果是增加中国居民硒膳食摄入量的有效途径。
    梨果实发育软化与果胶多糖降解特性的关系
    齐秀东,魏建梅,高海生,贾艳茹,张海娥
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3027-3037.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.012
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    【目的】探讨细胞壁果胶多糖降解特性与梨果实质地软化和贮藏性的关系,进一步阐明果实软化机理,为果实品质的提高及贮藏技术的完善提供理论依据。【方法】以‘鸭梨’和‘京白梨’为试材,根据果实发育和后熟特性,分别在果实发育和后熟软化两个阶段进行定期采样,用质构仪分析比较两品种果实的质构参数变化特性,分别采用生化方法和琼脂糖凝胶色谱柱层析法分析‘鸭梨’和‘京白梨’果实发育软化过程中细胞壁果胶组分含量变化及其分子质量的分布特点,并测定果胶多糖降解相关酶活性的动态变化规律,以探讨贮藏性不同的梨果实果胶多糖降解特性的差异。【结果】发育期,‘鸭梨’果实共价结合果胶(CSP)和离子结合果胶(ISP)含量迅速增加,显著高于‘京白梨’,其水溶性果胶(WSP)含量缓慢增加且低于‘京白梨’,‘鸭梨’果实WSP和CSP均由低分子量组分向高分子量组分转变。贮藏期,‘鸭梨’果实CSP含量高且恒定,WSP含量缓慢增加,但均保持较高的分子质量;而‘京白梨’果实CSP含量迅速降低,WSP和ISP含量快速增加,各果胶显著地由高分子量组分向低分子量组分转变。‘鸭梨’果实WSP、CSP和ISP含量变化仅在发育期与硬度变化显著相关,而‘京白梨’果实果胶与硬度的显著相关性主要表现在贮藏阶段。果胶降解酶活性测定结果表明,两品种的差异主要表现在贮藏期,即在贮藏阶段‘京白梨’果实多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Af)的活性和增加速率均显著高于‘鸭梨’,其中β-Gal和α-Af活性在‘京白梨’果实采收后即迅速增加,PG和PME相对滞后,且β-Gal和α-Af活性变化与硬度和各果胶组分含量变化间的相关度均强于PME和PG,此时期‘鸭梨’果实仅α-Af活性与ISP含量变化的相关性显著。综上,‘鸭梨’和‘京白梨’果实的果胶降解特性差异显著,而且在果实软化的不同阶段表现不同,导致两品种果实具有不同的后熟软化和贮藏特性。【结论】耐贮性强的‘鸭梨’果实发育期表现明显的大分子果胶组分积累和随果实后熟软化降解缓慢的特性,不耐贮的‘京白梨’果实发育期积累的大分子量果胶组分随果实软化迅速降解成小分子量组分。其中,难溶性果胶CSP含量的高低及其分子质量的分布是衡量梨果实耐贮性的重要指标。β-Gal和α-Af更促进‘京白梨’果实软化。
    专题:流感病毒对人类和畜牧业健康的影响
    专题导读:流感病毒对人类和畜牧业健康的影响
    王秀荣,陈化兰
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3038-3039.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.013
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        流感病毒是一种分节段的、有囊膜包裹的负链RNA病毒,属于正黏病毒科。根据其内部NP和M的不同,分为A、B、C三型[1]。到目前为止,禽流感(avian influenza,AI)只由A型流感病毒引起,B、C型流感病毒尚未在禽类体内发现。自然界中,A型流感病毒的宿主范围相当广泛,猪、马、虎、水貂、狐狸、猫、鲸、禽类以及人体内都分离到A型流感病毒,是人畜共患的重要呼吸道疾病病原,具有特殊的重要性。
        A型流感病毒基因组由8个片段组成,从大到小依次为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS,共编码11种病毒蛋白[2]。HA、NA与NP、M1、M2、PB1、PB2、PA共同构成病毒的组成成分,根据HA的不同将A型流感病毒进一步分为18个亚型。其中,H1—H16都能在禽类中发现,而H17—H18目前只在蝙蝠体内发现[3]。不同宿主中亚型分布存在差异,H1、H3在人群中广泛传播,H5、H7、H9在家禽体内流行广泛,野生水禽则是AIV的主要自然宿主,可以分离到H1—H16亚型的病毒,病毒在水禽体内长期存在而不表现明显临床症状。NS1蛋白能够直接调控病毒的复制过程,NS2介导病毒核糖核蛋白复合物的转运过程。后发现的PB1-F2蛋白与流感病毒介导的细胞凋亡有关[4]
        众所周知,1918年的西班牙H1N1流感,造成了美国50万人死亡,全球至少5 000万人死亡。近来利用反向遗传技术救获的来源于 1918 年流感基因的病毒相关研究表明,在动物模型中,1918年流感病毒 HA 基因对小鼠模型毒性增强起到了重要作用[5]。另外,1957 年亚洲H2N2流感造成 100 万人死亡,1968 年香港H3N2流感估计造成200万人死亡。2009 年暴发的 H1N1 大流感,到 2010423共引起超过17 853人死亡,该毒株致死率不高,但新病毒以前所未有的速度传播,在大约8周内传播到120个国家和地区,几乎所有国家都有报道。流感病毒对人类健康、社会发展和经济增长具有巨大影响及冲击。
      禽流感是A型流感病毒感染各种禽类的总称,对家禽养殖业危害非常严重。根据致病性不同,禽流感又划分为高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza,LPAI)。影响最大的是H5亚型HPAI,已在60多个国家的家禽和野鸟中检测出该亚型病毒,而且,在一些国家,主要是中国、印度、印度尼西亚、孟加拉国、埃及和越南,H5N1亚型禽流感已经发展成为危害养禽业健康发展的头号重要病原。不仅仅是H5N1,与H5亚型组合的还有2008年台湾爆发的H5N2亚型AI疫情[6],2014年初在日本和韩国爆发的H5N8亚型AI[7],今年美国也受到H5N8的严重影响,给养禽业造成重大损失。除H5亚型外,H7亚型HPAI也对家禽造成严重危害,2003年,荷兰、比利时以及德国等国家出现H7N7亚型HPAI[8],短短几周,荷兰共有约900个农场内的1 400万只家禽被隔离,1 800多万只病鸡被宰杀,引发H7N7禽流感蔓延欧洲。LPAI病毒通常不引起明显临床症状,但可引起鸡群生产性能下降,伴有其他疾病混合感染,环境影响时可造成严重后果,目前家禽体内流行广泛的LPAI以H9亚型为主。该亚型1966 年被报道引起威斯康星州火鸡发病以来,已在多个国家被分离和报道,可以感染多种禽类,如鸡、鸭、鹌鹑、野鸡、鹧鸪、鸽、丝羽乌骨鸡、欧石鸡等。中国1994年首次分离到了H9N2亚型病毒,临床表现为禽产蛋量下降,死亡率不高。
        禽流感除直接影响养禽业的发展外,还出现了直接感染人,引起严重的公共卫生的问题。1997年香港首次爆发了H5N1亚型HPAI跨越宿主屏障直接感染人并致死亡的事件[9],截止到2015年5月,全球共报告了人感染高致病性H5N1禽流感840例,其中死亡447例。病例分布于16个国家,其中,中国发现52例,死亡31例[10]。感染H5N1禽流感的多为年轻人和儿童。从1996—2012 年间,在荷兰、意大利、加拿大、美国、墨西哥和英国有报告人感染H7N2、H7N3 和 H7N7亚型流感病毒的事件,除荷兰有1人死亡以外,其他感染者大多仅有结膜炎和轻微的上呼吸道症状。在2013年3月,中国首次出现了人感染H7N9亚型流感病例,患者临床表现均类似于流感症状,早期主要为呼吸道症状,体温升高、咳嗽等症状,很快变成严重肺炎并出现呼吸困难。这是第一次报告人感染该亚型病毒,对人类健康造成了严重危害,引起广泛关注的事例。此外,还陆续发现了H9N2和H10N8等亚型AI感染人事件,控制其在家禽中流行以降低传播给人类的潜在风险是十分必要的。
        禽流感病毒不仅可以跨越种间障碍直接感染人,还为人的新型流感病毒提供供体基因。有证据表明 1918 年西班牙大流感是由 H1N1 禽流感传染给人类而引起的;1957 年亚洲大流感是由 人H1N1流感重组了禽H2N2流感PB1、HA 和 NA三个基因片段而引起的;1968 年,人H3N2亚型流感是由禽源 H3病毒提供 PB1和HA基因,由1957年大流感提供其他内部基因而形成的重组毒株,重组后成为一个新的大流行毒株;2009年H1N1大流感是来源于北美猪群中流行的三源重组毒[11],其PB2和PA来源于禽类;2013年人感染的H7N9流感病毒,其内部基因来自于H9N2禽流感病毒[12]。人类历史上出现的这几次大流行的流感病毒都与禽流感密切相关。
        本专题围绕目前中国兽医行业内流感研究工作新进展,集中报道了来自禽或猪体内流感病毒的生物信息学、致病机理和诊断技术等方面的研究成果。通过学术交流和讨论,加大对流感的宣传,促进公众对流感的认知,有助于提高人类对流感的防范意识,尽可能降低流感对社会秩序、食品安全和人类自身健康造成的冲击和负面影响。
    一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析
    赵晴晴,李群辉,朱杰,钟蕾,刘晶晶,顾敏,王晓泉,刘文博,刘秀梵
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3040-3049.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.014
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    【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(简称DK/NJ /1102)进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。
    H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立
    王云鹤,包红梅,孙佳善,李雁冰,徐晓龙,王子龙,施建忠,曾显营,王秀荣,陈化兰
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3050-3055.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.015
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    【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 106.5 EID50·mL-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1—H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1—N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1—N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×102.5 EID50·mL-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。
    H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析
    丁洁,高玉伟,桑晓宇,程凯慧,于志君,张坤,柴洪亮,王铁成,夏咸柱,华育平
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3056-3063.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.016
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    【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD50为103.5EID50,106EID50、105EID50、104EID50攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为106—103EID50的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3—8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在106EID50时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒的受体结合特性;JN病毒仅能在小鼠肺部检测到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T这两个点突变,就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。
    H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立
    亓文宝,李芳,李华楠,黄丽红,和君,穆光慧,罗开健,廖明
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3064-3070.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.017
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    【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS),并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru2+,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4—33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×104EID50,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒(H1、H3、H4、H5和H6亚型)和其他类型的禽源病毒(NDV、IBV和IBDV)反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。
    一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征
    徐汇洋,许榜丰,陈艳,隋金钰,杨焕良,尹航,杨大为,乔传玲,陈化兰
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3071-3078.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.018
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    【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用 MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主(猪和人)上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个(N27、N40、N212和N291)位于HAl区,2个(N498和N557)位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个(N50、N58、N63和N68)在链接区,其他3个(N88、N146和N235)在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】 类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。
    研究简报
    大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析
    许玲,卫培培,张大勇,徐照龙,何晓兰,黄益洪,马鸿翔,邵宏波
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3079-3089.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.019
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    【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子GmMYB111;以盐胁迫处理的cDNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因cDNA编码序列;根据GmMYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与GmMYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用 MEGA5.05对GmMYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析GmMYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据获得盐胁迫响应显著上调(27倍)的GmMYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB76、GmMYB12a以及苜蓿MtMYB61的亲缘关系最近; GmMYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,GmMYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,GmMYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,GmMYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示GmMYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,GmMYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】GmMYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。
    不同品种鸡蒸煮加工适宜性评价技术研究
    王春青,李侠,张春晖,李学科,杜桂红,李海,谢小雷
    中国农业科学. 2015, 48(15):  3090-3100.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.020
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    【目的】选取不同品种鸡为研究对象,分析肉鸡原料肉以及蒸煮肉样品质,为筛选鸡肉蒸煮加工专用品种提供参考。【方法】分别测定10个不同品种鸡原料肉的16项品质指标以及经过蒸煮加工后肉样的9项品质指标。对所测得的指标进行相关分析,建立原料肉品质与蒸煮肉样品质的相关性;运用因子分析筛选出蒸煮加工的品质评价指标;运用层次分析,确定品质评价指标的权重;运用“合理-满意度”的评价方法,确定综合评价得分;并结合聚类分析,将10个品种肉鸡分为不同等级;运用回归分析,进行综合评价模型验证。【结果】不同品种鸡胸肉基本品质指标之间呈显著差异性(P<0.05)。经过煮制,样品的剪切力、硬度、弹性以及咀嚼性均增加,肌节长度缩短,但品种之间收缩率呈显著差异,其中柴母鸡肌节收缩率为30.41%,显著高于其他9种鸡(P<0.05),而矮脚鸡肌节收缩率为4.99%。品种间原料肉及其煮制肉样品质指标变异较大。其中,原料肉指标中脂肪含量和肌原纤维密度的变异系数较大,分别为60.51%和48.62%,但是在加工产品中肌节收缩率、咀嚼性和剪切力的变异系数较大,分别为48.33%,34.64%和20.51%,因此,10个品种肉鸡可以作为代表样品。相关分析结果表明,原料肉指标脂肪含量、亮度值(L*)、剪切力、蒸煮损失率、硬度、咀嚼性、肌节长度、肌节收缩率及体积收缩率与煮制肉样的品质指标相关性极显著(P<0.01),其中原料肉的剪切力与产品剪切力,原料肉的硬度和咀嚼性与产品硬度之间相关系数分别达到0.59、0.62和0.48;因子分析结果表明,前5个因子的特征值均大于0.8,同时9个品质指标中(脂肪含量、L*、剪切力、蒸煮损失率、硬度、咀嚼性、肌节长度、肌节收缩率及体积收缩率)7个指标对前5个因子的贡献率较大。因此,筛选出原料肉指标脂肪含量、剪切力、硬度、咀嚼性、肌节长度、肌节收缩率及体积收缩率作为品质评价指标,代表原来所有指标的90.09%的信息;层次分析确立品质评价指标的权重,分别为0.0603、0.1045、0.0920、0.2223、0.0416、0.1898及0.2896,同时建立品质评价方程为Y=0.0603×M脂肪含量+0.1045×M剪切力+0.0920×M硬度+0.2223×M咀嚼性+0.0416×M肌节长度+0.1898×M肌节收缩率+0.2896×M体积收缩率;通过聚类分析,将10个品种鸡分为3类;回归分析结果表明,评价模型与感官评价结果相近,其回归方程为y=1.899x-0.510,相关系数为0.887,综合评价模型可以较准确的评价鸡肉蒸煮加工适宜性。【结论】在10个品种肉鸡中,通过原料肉品质指标进行分析,清远鸡、白羽肉鸡和童子鸡最适宜蒸煮加工,柴母鸡不适宜蒸煮。