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当期目录

    2014年 第47卷 第15期 刊出日期:2014-08-01
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    水稻斑马叶突变体zebra524的表型鉴定及候选基因分析
    李燕群, 钟萍, 高志艳, 朱柏羊, 陈丹, 孙昌辉, 王平荣, 邓晓建
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2907-2915.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.001
    摘要 ( 361 )   HTML ( 1 )   PDF (726KB) ( 799 )   收藏
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    【目的】对水稻斑马叶突变体zebra524进行表型鉴定和候选基因分析,为进一步探讨该基因功能及在农业生产上的应用奠定基础。【方法】用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变粳稻品种日本晴建立突变体库,从突变体库中筛选得到1份苗期为斑马叶的突变体,该突变体被命名为zebra524。对突变体的表型进行系统观察,并调查其主要的农艺性状。然后,分别测量突变体苗期和孕穗期的叶片及灌浆期籽粒颖壳的光合色素含量。将突变体分别与正常绿色品种进行杂交,并调查杂交F1叶色表型和F2群体叶色分离情况。利用zebra524×冈46B的F2作为定位群体,对zebra524突变体进行基因定位和候选基因遴选,并进行DNA测序验证及编码蛋白序列同源性分析。【结果】zebra524突变体表现为苗期叶片白色和淡绿色横向相间的斑马叶,孕穗期叶片上白色的区域完全转变为淡绿叶并且新长出的叶子表现为淡绿色,抽穗至灌浆结实期籽粒的颖壳苍白色,成熟期节呈褐色、节间基部呈粉红色、胚和颖果基部呈橙红色以及在黑暗条件下培养萌发的胚芽呈橙红色。该突变体苗期及孕穗期叶片叶绿素含量分别降低82.8%和20.9%,类胡萝卜素含量分别降低64.7%和32.6%;灌浆结实期籽粒颖壳的叶绿素和胡萝卜素含量分别降低38.1%和42.8%。成熟期,zebra524突变体的株高、每穗着粒数、结实率和千粒重比野生型分别减少12.3%、9.5%、13.0%和5.4%。zebra524突变体F1的植株叶片表现为正常的绿色,杂交F2群体中正常植株与突变植株分离明显,正常叶色植株数目与突变植株数目的比值接近3﹕1,表明zebra524的突变性状是由1对隐性核基因控制。该突变基因被定位于第2染色体短臂上的SSR标记RM7082和InDel标记Y2之间,遗传距离分别为0.5 cM 和1.7 cM,这2个标记之间的物理距离约为235 kb。序列分析发现,zebra524突变体在LOC_Os02g09750编码区第235碱基处碱基G突变为碱基T,使得编码蛋白的氨基酸序列第79位甘氨酸(Gly)突变成半胱氨酸(Cys)。【结论】zebra524的突变基因与已报道的β-OsLCY等位,该突变体表型可能是由于β-OsLCY发生单碱基突变造成的。
    小麦骨干亲本京411及衍生品种苗期根部性状的遗传
    肖永贵1, 路亚明1, 闻伟锷1, 陈新民1, 夏先春1, 王德森1, 李思敏1, 童依平2, 何中虎1, 3
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2916-2926.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.002
    摘要 ( 334 )   HTML ( 1 )   PDF (1007KB) ( 654 )   收藏
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    【目的】利用高密度SNP标记解析骨干亲本京411的遗传结构,并研究其根系性状遗传特征,为培育高产广适性品种奠定基础。【方法】选用京411及其14个衍生品种(系),包括衍生一代6份,衍生二代8份,每品种选取饱满且大小一致的种子在发苗网上生长6 d,每份材料选取大小一致的幼苗转移至培养盘,每个培养盘种植3次重复,连续培养15 d后测定苗期根部性状的最长根长、侧根长、主根长、总根长、侧根表面积、主根表面积、总根表面积、总根尖数和根系干重。利用90K SNP芯片分析京411及其衍生后代群体的遗传结构和遗传区段传递,结合逐步回归分析定位苗期根部性状基因,探讨京411携带的优异根系基因在衍生后代中的分布。【结果】京411衍生群体平均遗传相似性为57.9%,该亲本与其衍生一代和衍生二代相同的等位变异频率分别为63.9%和67.9%,显著高于理论值。在A、B和D基因组间的相同等位变异频率分别为62.2%、61.3%和74.3%。京411的侧根和根尖数均优于其衍生品种,衍生品种的主根长和根干物质重量等性状的改良较为显著。以已有定位信息的SNP标记与根系性状进行逐步回归分析,共发掘出35个根系性状位点,3DL和5BL上携带控制根长性状的主效位点,分别与SNP标记wsnp_Ex_c1032_1972861和BS00100708_51关联,可用于京411衍生群体中分子辅助选择。来自京411的26个位点对根部性状起正向效应,中麦175和CA0958携带正向效应区段最多,占正向效应位点总数的73.1%。【结论】传统育种对地上部农艺性状的选择,可有效促进地下根系的改良,相当于对优异性状遗传片段的聚合。在京411衍生群体中,中麦175是针对骨干亲本遗传改良最成功的品种,不仅携带较多的京411优异根系基因,而且其主要根系性状、产量表现及广适性均优于京411。
    不同基因型大豆耐荫性分析及其鉴定指标的筛选
    李春红1, 2, 姚兴东1, 鞠宝韬1, 朱明月1, 王海英1, 张惠君1, 敖雪1, 于翠梅1, 谢甫绨1, 宋书宏2
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2927-2939.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.003
    摘要 ( 371 )   HTML ( 1 )   PDF (728KB) ( 583 )   收藏
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    【目的】探讨作物耐荫性评价的方法,分析不同大豆基因型耐荫特性,筛选鉴定指标,建立可靠的耐荫性评价模型。【方法】以30个大豆品种(系)为试材,采用田间试验的方法,设遮光和自然光照2个处理。遮光处理采用玉米-大豆带状复合种植在田间创设荫蔽条件,玉米品种为郑单958,在玉米植株长成以后,遮光率为70%;大豆清种作为对照。在成熟期调查主茎高(X1)、茎粗(X2)、主茎节数(X3)、分枝数(X4)、底荚高度(X5)、节间长度(X6)、植株重量平衡点(X7)、倒伏性(X8)、单株荚数(X9)、单株粒数(X10)、每荚粒数(X11)、百粒重(X12)、粒茎比(X13)和单株产量(X14)。根据遮光处理和自然光照条件下的各项指标的耐荫系数,采用主成分分析、隶属函数法、聚类分析和逐步回归分析方法,对大豆的耐荫性进行综合评价。【结果】通过主成分分析将14个单项指标转换为5个相互独立的综合指标,代表了全部数据87.685%的信息量。通过隶属函数法计算综合耐荫评价值(D),并对其进行聚类分析,将30个大豆品种(系)按照耐荫性的强弱划分为3类。第Ⅰ类属于强耐荫类型,第Ⅱ类属于中度耐荫类型,第Ⅲ类属于不耐荫类型。通过逐步回归建立大豆耐荫性评价数学模型,D=-0.5495+0.2932X3+0.0592X4+0.1628X6-0.0244X8+0.5943X9+0.1345X12+0.8210X14(R2=0.9908),估计精度在93.67%以上,并筛选出7个鉴定指标,分别是主茎节数、分枝数、节间长度、抗倒性、单株荚数、百粒重和单株粒重。【结论】30个大豆品种(系)被分成强耐荫型、中等耐荫型和不耐荫型3类,且主茎节数、分枝数、节间长度、抗倒性、单株荚数、百粒重和单株粒重可以作为大豆耐荫性的鉴定指标。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    干旱胁迫下小麦(Triticumaestivum L.)幼苗中ABA 和IAA的免疫定位及定量分析
    张炜1, 高巍2, 曹振1, 何丽珊1, 谭桂玉1, 王保民1
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2940-2948.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.004
    摘要 ( 406 )   HTML ( 1 )   PDF (1042KB) ( 866 )   收藏
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    【目的】干旱是农业生产中存在的严重问题,是制约作物生长和限制农业种植面积进一步扩大的最主要因素,探明植物抗旱机理,将为农业增产增收提供重要保障。本试验旨在分析干旱胁迫下小麦幼苗中(根、叶鞘、叶片)脱落酸(ABA)和吲哚乙酸(IAA)的定位及含量,探索其动态变化规律,为干旱地区作物栽培的激素调控、干旱条件下小麦的化学调控提供理论依据。【方法】以冬小麦品种鲁麦21号为材料,采用温室盆栽自然干旱法,以免疫组织化学定位方法研究干旱胁迫下小麦幼苗(根、叶鞘、叶片)中内源激素ABA和IAA的定位,并用间接酶联免疫吸附测定法(icELISA)进行内源ABA和IAA含量分析。通过比较免疫组织化学定位的化学信号强度和icELISA检测的内源ABA和IAA含量,验证本试验结果的有效性。【结果】称重法控制水分持续干旱4周后,对照组(CK)小麦植株直立生长,叶片健康呈绿色,长势良好。干旱处理组(ND)小麦植株矮小,叶片面积减小,有不同程度的萎蔫和发黄现象。干旱胁迫下小麦幼苗根、叶鞘、叶片中的ABA免疫组织荧光信号均强于对照,其中叶片强弱差异最显著,叶鞘次之,各器官中保卫细胞和维管的强弱对比最为明显;IAA免疫荧光信号强度也高于对照,但相比ABA不明显;用icELISA进行定量分析,比较免疫组织化学定位的信号强度和icELISA检测的内源激素含量表明,上述免疫组织化学定位结果与icELISA的测定结果相一致,其中,根中的ABA含量为61.51 ng•g-1 FW,是对照的2.82倍(21.8 ng•g-1 FW);叶鞘中ABA含量增加幅度较大,为175.35 ng•g-1 FW,是对照的3.65倍(48.02 ng•g-1 FW);叶片中ABA含量增幅最大(512.12 ng•g-1 FW),为对照的10.16倍(50.42 ng•g-1 FW)。显著性分析表明,干旱胁迫与正常供水小麦幼苗根、叶鞘、叶片中ABA含量差异均呈极显著(P<0.01)。用icELISA对IAA进行检测,正常供水时,小麦幼苗根、叶鞘、叶片中的IAA含量分别为72.81、274.46 和195.75 ng•g-1 FW。水分胁迫条件下,IAA含量增加但幅度不大,分别为123.56、400.48 和417.30 ng•g-1 FW。叶片中IAA上升的幅度稍大为对照的2.13倍,根、叶鞘中的IAA含量分别为对照的1.70和1.46倍。显著性分析(t检验法)显示,在干旱胁迫与正常供水条件下小麦幼苗根中IAA含量差异不显著(P>0.05),但叶片和叶鞘中IAA含量差异极显著(P<0.01)。【结论】水分胁迫下小麦幼苗根、叶鞘、叶片中ABA和IAA含量均增加,ABA含量增加幅度较大,IAA较ABA含量增加幅度较小。二者之间协调的总趋势是向着气孔关闭,促进根系生长,减缓茎叶生长速率的方向发展,可有效的避免缺水伤害。
    综合农艺管理对夏玉米叶片衰老特性的影响
    朱昆仑, 靳立斌, 董树亭, 赵斌, 刘鹏, 张吉旺
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2949-2959.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.005
    摘要 ( 305 )   HTML ( 1 )   PDF (678KB) ( 693 )   收藏
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    【目的】研究综合农艺管理对夏玉米叶片衰老特性的影响。【方法】以郑单958为试验材料,对播期、播种方式、密度、氮肥施用时期及用量和收获时间等农艺措施进行优化组合,设置综合农艺管理试验,共4个处理:按当地农户习惯即麦田后期套种玉米、苗期一次性施氮和苞叶变白、籽粒变硬时收获等设置为处理1(T1);在此基础上改套种为直播,减少氮肥施用量,优化施肥时期,延迟收获时间,设置为处理2(T2);在T2的基础上进一步提高施肥量,增加磷、钾肥比例,将氮肥分次施用,增加种植密度,以期达到最高产量,设置为处理3(T3);在T3的基础上减少施肥量,进一步优化施肥时期,适当降低种植密度,设置为处理4(T4)。然后以T4处理为基础设置单因素施氮量试验(0、129.0、184.5和300.0 kg N•hm-2,分别记作N0、N1、N2和N3),研究综合农艺管理和施氮量对夏玉米叶面积指数、叶片光合色素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响。【结果】从大喇叭口期(V12)到抽雄后42 d,T4处理的LAI平均维持在4.4以上,显著高于T1和T2处理,且后期下降缓慢。在施氮量试验中,LAI随施氮量的增加而增加,从抽雄后28 d到成熟期(R6),N3的LAI平均下降了14.9%,高于其他施氮处理的降幅。综合农艺管理试验(MT)和施氮量试验(NT)的叶片光合色素含量均呈单峰曲线变化,在抽雄后14 d达到最大值,之后逐渐下降,从抽雄后14—42 d,T1、T2、T3和T4处理叶绿素(a+b)的含量分别减少了21.1%、22.0%、27.2%和18.4%,类胡萝卜素含量分别减少了26.6%、26.9%、32.2%和25.0%。抽雄后42 d,T4的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)和类胡萝卜素含量分别较T1提高了6.0%、13.0%、6.9%和9.3%。NT试验中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素(a+b)的含量随施氮量的增加而增加;N3处理的类胡萝卜素含量生育后期急剧下降,到抽雄后42 d,N3处理的类胡萝卜素含量较N0降低4.5%。MT和NT试验各处理穗位叶的SOD、CAT和POD活性均呈单峰曲线变化,在抽雄后14 d达到最大值,之后逐渐下降,T4处理的SOD、CAT和POD活性始终维持在较高水平且后期下降缓慢;NT试验中随施氮量增加,SOD、CAT和POD活性增加,但是,与N2处理相比较,N3 的LAI和叶片的SOD活性、CAT活性等未全部随施氮量增加而显著增加,且N3处理生育后期叶片保护酶活性下降快于其他施氮处理。随生育进程的推进,MT和NT处理穗位叶的MDA含量均呈上升趋势,T4处理始终维持在较低水平,增施氮肥叶片MDA含量逐渐降低。【结论】在75 000株/hm2种植密度条件下,当施氮量超过184.5 kg•hm-2后,继续单一增施氮肥不能持续增加保护酶活性,减少MDA含量,且导致保护酶活性下降加快,MDA含量增加变快,不利于氮素的高效利用。通过改麦套为麦收后直播、适当增加种植密度、分次合理施氮和适期收获等综合农艺措施优化可提高叶片光合色素含量且生育后期降低缓慢,叶片保护酶活性较高,MDA含量维持较低水平,这可能是其产量和氮素效率提高的原因。
    河西制种基地玉米杂交种种子成熟期与种子活力的关系
    樊廷录1, 王淑英1, 王建华2, 杨珍3
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2960-2970.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.006
    摘要 ( 291 )   HTML ( 1 )   PDF (757KB) ( 534 )   收藏
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    【目的】研究河西制种基地玉米杂交种种子成熟度与种子活力的关系,确定高活力种子的适宜收获期,为种子企业躲避早秋霜冻提供依据。【方法】选择硬粒型先玉335、马齿型郑单958和吉祥1号3个杂交种制种田,授粉后每隔3—5 d采集果穗测定籽粒水分,实验室进行标准发芽和冷浸抗冷试验,测定种子发芽率和浸出液电导率,籽粒乳线发育按5级分类法记录:1=整个胚乳是液体状,无乳线;2=种子长度的25%充满硬化胚乳层,乳线出现在离种子顶部1/4处;3=种子长度的50%充满硬化胚乳层,乳线出现在种子1/2处;4=种子长度的3/4含硬化胚乳层,乳线下移到接近种子基部;5=整个种子是硬化的胚乳层,乳线消失。【结果】不同玉米杂交种、授粉后不同采收期对籽粒水分、脱水速率、种子发芽率和活力影响达到极显著水平,先玉335脱水早、脱水快,授粉后32 d时籽粒水分比郑单958、吉祥1号低10%—15%,授粉后32—75 d随着灌浆的进行果穗籽粒水分递减,平均生理脱水速率先玉335(0.70%/d)高于郑单958(0.62%/d)和吉祥1号(0.49%/d),籽粒水分每减少1%,先玉335、郑单958和吉祥1号百粒重依次增加0.73 g、0.50 g、0.29 g。不同采收期种子成熟度和种子活力有较大差异,籽粒水分为70%—40%,随着水分降低,种子发芽率增加、浸出液电导率减少,水分每减少1%,先玉335、郑单958和吉祥1号发芽率依次提高3.37%、2.76%、1.67%。随着灌浆时间推后,籽粒发芽率增加、电导率降低,但杂交种之间有一定差异,授粉后32 d 3个杂交种标准发芽率为30.0%—59.0%,6℃冷浸3 d发芽率为2.5%—36.9%,授粉47 d以后先玉335冷浸芽率与标准发芽率接近,而郑单958、吉祥1号冷浸发芽率始终明显低于标准发芽率,即种子抗低温能力大小为先玉335>郑单958>吉祥1号。种子发育过程中籽粒水分与乳线发育明显相关,随着水分减少乳线下移,先玉335籽粒乳线出现早、消失也早,郑单958次之,吉祥1号乳线出现最迟、消失最晚,乳线发育到籽粒1/2处时,籽粒水分降到38%—40%,种子标准发芽率和冷浸发芽率均接近较高值,此时先玉335、郑单958百粒重占生理成熟时最大百粒重的76.6%和88.0%。【结论】玉米种子成熟度影响种子活力大小,发芽率和活力最大的采收期宜在乳线到籽粒中部位置,此时籽粒水分40%左右,而不是干物质达到最大的生理成熟期,甘肃武威制种基地先玉335高活力种子的适宜采收期开始于授粉后47 d,而郑单958和吉祥1号在授粉后60 d,比目前生产收获期提前10—15 d,可避免早霜冻对玉米种子质量的影响。
    植物保护
    灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能
    李培芬, 赵福鑫, 董丽萍, 郑会欣, 赵斌, 张靖, 司贺龙, 邢继红, 韩建民, 董金皋
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2971-2979.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.007
    摘要 ( 283 )   HTML ( 1 )   PDF (661KB) ( 630 )   收藏
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    【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型(菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等)和致病力进行分析。【结果】BcKMO编码犬尿氨酸单氧酶(kynurenine 3-monooxygenase,KMO),含有单氧酶FAD的保守结构域和4个类似芳香环羟化酶(Aromatic-ring hydroxylase-like)的基序,与核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的Rossmann卷曲NAD(P)(+)-结合蛋白(Rossmann-fold NAD(P)(+)-binding proteins,gi156049701)和从线嘴壳(Ophiostoma piceae)的FAD依赖性氧化还原酶(FAD-dependent oxidoreductase,gi512192943)同源性较高。成功构建了BcKMO的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP,利用PEG介导的转化方法,转化突变体BCG183的原生质体,获得了草胺膦抗性的转化子;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术鉴定转化子,获得了BcKMO的回复突变体BCG183/BcKMO。对突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型进行了分析,发现BCG183突变体的生长速率减慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝纤细;回复突变体和野生型菌株的生长速率、菌丝形态基本一致,均产生分生孢子和菌核。致病力分析发现,BCG183突变体在芸豆叶片和黄瓜叶片上的致病力均较野生型和回复突变体明显增强。【结论】灰葡萄孢BcKMO正调控病菌的生长、发育,负调控病菌的致病力。
    苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析
    宋娜, 戴青青, 宋娜, 黄丽丽, 韩青梅
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2980-2989.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.008
    摘要 ( 291 )   HTML ( 1 )   PDF (695KB) ( 616 )   收藏
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    【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1(暂命名),该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(hph)进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。
    北京地区二斑叶螨不同种群的药剂敏感性
    宫亚军1, 王泽华1, 石宝才1, 崔文夏1, 金桂华1, 孙艳艳2, 魏书军1
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2990-2997.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.009
    摘要 ( 328 )   HTML ( 1 )   PDF (615KB) ( 472 )   收藏
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    【目的】明确北京地区作物上二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)不同种群对杀螨剂的敏感性水平,了解二斑叶螨对药剂敏感性与体内4种解毒酶活力的相关性。【方法】在实验室内采用改进的玻片浸渍法(slide-dip method)检测北京房山、怀柔、昌平、延庆和平谷5个地区二斑叶螨田间种群对联苯肼酯、阿维菌素、螺螨酯和哒螨灵4种杀螨剂的敏感性;采用PCR技术对单头叶螨的CYTB基因进行扩增和测序,检测二斑叶螨对联苯肼酯的抗性突变位点;并采用酶标仪微量板法,检测二斑叶螨体内与抗性相关的多功能氧化酶、乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活力。【结果】5个田间种群对联苯肼酯最敏感,其LC50分别为2.4880、6.4693、6.2398、0.7882和14.7783 mg•L-1。对阿维菌素的敏感性次之,其LC50分别为22.4712、35.4431、14.5260、15.4904和14.0023 mg•L-1。对螺螨酯和哒螨灵的敏感性非常低,螺螨酯的LC50分别为49.6833、81.8826、72.9609、204.4609和1 433.5137 mg•L-1,哒螨灵的LC50分别为202.6902、806.8324、375.3518、188.3234和2 310.9040 mg•L-1。延庆地区二斑叶螨乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性显著高于其他地区,其活力分别为14.9508 U/(mg protein)、0.2271 μmol•mg-1 protein•30 min-1和58.2962 U/(mg protein)。怀柔地区多功能氧化酶的活性显著低于其他地区,其活力为1.4272 μmol•mg-1 protein•30 min-1。联苯肼酯、阿维菌素、螺螨酯和哒螨灵的敏感性水平与乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶的酶活力之间没有直接的线性关系;采用PCR技术对5个地区的288个二斑叶螨个体进行CYTB基因检测后,仅发现怀柔地区的一个个体CYTB基因第126位氨基酸密码子的第一位核苷酸由G突变为A导致氨基酸由G突变为S,其余地区均无突变,这与生物测定方法中各地区对联苯肼酯较敏感的结果基本一致。【结论】北京地区二斑叶螨不同种群对联苯肼酯敏感性最高,对阿维菌素的敏感性次之,对螺螨酯和哒螨灵敏感性非常低;二斑叶螨对4种杀螨剂的敏感性水平与乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶的酶活力之间没有直接的线性关系;通过检测到的基因突变个体,说明怀柔地区二斑叶螨种群中存在着对联苯肼酯产生高抗性风险的个体。PCR方法能够更加快速准确地检测种群抗性发展程度。基于以上结果,在农业防治二斑叶螨中应降低联苯肼酯使用频率,交替使用阿维菌素,避免使用螺螨酯,停止使用哒螨灵,以延缓和降低二斑叶螨产生抗性的风险。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    多种时序NDVI重建方法比较与应用分析
    张晗1, 任志远1, 2
    中国农业科学. 2014, 47(15):  2998-3008.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.010
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (734KB) ( 700 )   收藏
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    【目的】NDVI时序数列能够模拟植物的生长过程,反映其生长状况。目前重建NDVI时序数列的方法有很多,由于模型和参数的不同导致结果存在不确定性以及偏差。本研究旨在对比3种模型(Whittaker平滑、HANTS和Savitzky-Golay滤波)在物候提取和复种指数提取中的应用,以探讨各模型的优缺点。【方法】采用16 d间隔的MODIS MOD13Q1 2000—2012年陕西地区影像,利用3种模型拟合重建NDVI时序数列。首先,将研究区划分为3个气候区,每区分别选择林地和耕地两个采样点,视觉比较各采样点3种模型拟合效果。其次,通过均方根误差、相关系数和信噪比对比各模型拟合精度,并探讨不同植被类型之间拟合精度的差异。然后,采用动态阈值法提取13年植被物候参数(生长开始日期SOS、生长结束日期EOS、生长周期LOS),对比模型提取不同植被类型物候参数均值和标准差的差异。最后,利用二次差分算法和提取规则获取陕西13年复种指数,对比3种模型提取和统计年鉴计算复种指数之间的差异。【结果】Savitzky-Golay滤波拟合精度较高,复种指数提取精度较高,但是提取物候参数方面存在较大误差;HANTS提取物候参数效果较好,但参数设置复杂以及精度较差;Whittaker平滑参数设置简单,能有效降低原始影像的信噪比,在精度和物候参数提取均表现良好;均方根误差和相关系数作为精度检验的标准,二者存在负相关,相关系数比均方根误差更灵敏。【结论】Whittaker平滑能够很好地平衡NDVI时序数列的保真度和粗糙度,在提取物候参数方面表现良好,在提取复种指数方面还有待进一步研究。
    利用CMIP5多模式集合模拟气候变化对中国小麦产量的影响
    杨绚1, 汤绪2, 陈葆德3, 田展4, 赵思健5
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3009-3024.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.011
    摘要 ( 346 )   HTML ( 1 )   PDF (874KB) ( 653 )   收藏
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    【目的】利用最新的国际耦合模式比较计划第五阶段(CMIP5)中30个全球大气-海洋耦合模式(AOGCMs)在典型浓度路径(RCPs)情景下的气候预估结果,基于集合模拟的方法评估气候变化对中国未来小麦产量的影响。【方法】气候变化对农业的影响评估通常基于未来逐日的气象资料,然而AOGCMs模拟的逐日数据存在较大的不确定性。利用“虚拟气候变暖”(PGW)的方法,将CMIP5模式预估的未来气候变化的信号与当前气候的逐日站点观测资料相结合,得到未来气候预估的逐日数据集合。结合作物过程模型CERES-Wheat,利用集合模拟的方法,以概率的形式量化表述气候变化对中国小麦产量影响的不确定性。【结果】未来中国冬春小麦代表站在其小麦生育期内的平均气温均有升高。预估21世纪末期,冬小麦代表站平均增温2.7—2.9℃,春小麦代表站平均增温3.0—3.3℃。RCP8.5情景比RCP2.6情景增温显著。预估未来冬、春小麦在其生育期内的降水量普遍增加,并随着排放量的增长,降水量表现出逐渐增多的趋势。在仅改变未来气候变化的条件下,冬、春小麦的灌溉小麦单产相对于1996—2005年普遍减产,并且随着气候变化,灌溉小麦的减产概率上升。春小麦代表站在灌溉条件下小麦减产的程度比冬小麦代表站更显著。预估到21世纪末期,冬小麦代表站在RCP2.6情景下减产2%左右,在RCP4.5情景下减产6%左右,在RCP8.5情景下减产9%左右,减产概率超过85%。预估春小麦代表站在RCP2.6情景下减产5%,在RCP4.5情景下减产8%以上,在RCP8.5情景下减产15%以上,减产概率超过90%。在雨养条件下,冬小麦代表站的小麦单产相较于1996—2005年显著增产。预估到21世纪末期,冬小麦代表站在RCP2.6情景下增产21%以上,在RCP4.5情景下增产22%以上,在RCP8.5情景下增产25%以上,增产概率超过90%。【结论】利用PGW方法获得未来气候预估的逐日数据集合有效的保留了当前气候的天气信息,尤其是极端天气事件的信息。利用集合模拟的方法评估未来气候在RCP2.6、RCP4.5和RCP8.5情景下对中国小麦单产的影响,表明在灌溉条件下,随着排放量的增加,气候变化导致中国小麦单产减产的概率逐渐上升。雨养小麦单产集合的不确定性较灌溉条件大。
    园艺
    秋水仙素对大蒜茎尖试管苗四倍体的诱导
    孔素萍1, 2, 曹齐卫2, 孙敬强2, 刘波2, 徐坤1
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3025-3033.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.012
    摘要 ( 316 )   HTML ( 3 )   PDF (622KB) ( 561 )   收藏
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    【目的】大蒜为无性繁殖作物,难以采用常规育种方法选育新品种,而化学诱变作为种质创制的重要方法之一,在一些作物上获得了较好的效果。探讨秋水仙素对大蒜茎尖组培试管苗多倍体的诱变效应,旨在为创新大蒜种质提供理论依据和技术方法。【方法】选用山东‘苍山蒲棵’、四川‘正月早’和‘新疆紫皮’3个生态区域的大蒜品种,鳞茎经自然晾干通过休眠后,取鳞芽茎尖为外植体接种到不同处理的培养基上,采用二次饱和-D最优设计方法,研究秋水仙素不同浓度及处理时间对大蒜茎尖试管苗成苗率及染色体加倍率的影响,并建立相关回归模型;通过对回归模型进行解析,确定诱变大蒜四倍体的优化方案;采用流式细胞仪检测幼叶和根尖压片染色体计数相结合的方法进行染色体倍性鉴定。【结果】利用流式细胞仪检测的四倍体大蒜植株叶片DNA相对含量是二倍体对照大蒜‘苍山蒲棵’的2倍;通过染色体计数法鉴定二倍体植株根尖染色体为2n=2x=16,而四倍体植株染色体为2n=4x=32。在秋水仙素处理大蒜茎尖诱变四倍体过程中,随秋水仙素处理浓度的升高及时间的延长,3个大蒜品种试管苗成苗率均逐渐降低,且处理浓度的影响大于处理时间;品种间成苗率存在显著差异,以‘正月早’较高,‘新疆紫皮’次之,‘苍山蒲棵’较低,其处理间平均成苗率分别为48.69%、46.73%和41.83%。秋水仙素对大蒜四倍体的诱变效应以处理浓度大于处理时间,不同大蒜品种对秋水仙素的反应存在显著差异,虽然‘苍山蒲棵’、‘正月早’与‘新疆紫皮’的最高四倍体诱导率分别达15.69%、15.69%和23.53%,但大蒜四倍体平均诱导率则以‘正月早’最高,‘苍山蒲棵’次之,‘新疆紫皮’最低,分别为9.15%、7.84%和6.53%。经计算机模拟寻优,求得的3个大蒜品种试管苗成苗率均超过50%的处理方案为秋水仙素浓度为0.268%—0.694%、处理时间为61.1—113.8 h;3个大蒜品种四倍体诱导率均超过5%的秋水仙素处理浓度和时间分别为0.531%—0.580%和79.8 —112.2 h。【结论】不同大蒜品种对秋水仙素处理浓度和处理时间的反应不同,秋水仙素对大蒜四倍体的诱变效应亦存在显著差异,但均以处理浓度的影响大于处理时间,且处理浓度与处理时间存在互作效应。3个大蒜品种成苗率超过50%且四倍体率超过5%的秋水仙素处理浓度为0.531%—0.580%、处理时间为79.8—112.2 h。
    野生秋子梨(Pyrus ussuriensis Maxim)果实性状的遗传多样性
    安萌萌1, 王艳廷1, 宋杨2, 冀晓昊1, 刘畅3, 王楠1, 吴玉森1, 刘文1, 4, 曹玉芬2, 冯守千1, 陈学森1
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3034-3043.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.013
    摘要 ( 374 )   HTML ( 1 )   PDF (664KB) ( 555 )   收藏
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    【目的】探讨野生秋子梨果实形态、香气物质及糖酸组分的遗传变异及遗传多样性,为野生秋子梨种质资源的保护与利用提供基本资料。【方法】以迁地保存圃的35个野生秋子梨实生株系的果实为试材,以‘小香水’梨、‘京白’梨和‘南果’梨3个秋子梨栽培品种为对照,测量果实的纵径、横径、果形指数(纵径/横径)及单果重,采用静态顶空和气相色谱-质谱联用、高效液相色谱技术,定性、定量分析果实的糖酸组分和香气物质。【结果】 野生秋子梨各实生株系果实大小、香气成分总含量、各类香气成分种类数及其含量、主要香气成分分离比率与具体含量、各糖酸组分的含量、总糖以及总酸含量等均存在广泛的遗传变异,变异系数均在17%以上,各株系间差异明显,表现出丰富的遗传多样性;进一步与3个栽培品种比较发现,野生秋子梨的果实纵径、横径及单果重均小于3个栽培品种,但果形指数比较接近;野生秋子梨平均每个株系检测出41种香气成分,明显高于栽培品种的平均香气种类(25种);野生秋子梨平均香气成分含量为9.44 μg•g-1,显著高于3个栽培品种的平均含量(5.71 μg•g-1);野生秋子梨与栽培品种相比,含有酸类和烃衍生物类2类特有化合物,含有酯类等9类111种特有成分;野生秋子梨与3个栽培品种共检测出16种特征香气,其中1-己醇和己醛等8种化合物为野生秋子梨与3个栽培品种共有的特征香气,乙酸己酯和乙酸戊酯等8种特征香气为野生秋子梨特有;35个野生秋子梨实生株系和栽培品种中几乎均能检测出果糖、葡萄糖和蔗糖等3种糖组分以及苹果酸、酒石酸和柠檬酸等6种酸组分,且均以果糖和苹果酸含量最高;野生秋子梨中酒石酸及蔗糖含量明显高于栽培品种,其他糖酸组分、总糖及总酸含量最大值均高于3个栽培品种。【结论】野生秋子梨在果实形态、糖酸组分及香气成分上存在广泛的遗传变异,参试的35个实生株系间差异明显,遗传多样性极为丰富,并且含有酸类和烃衍生物类2类特有化合物和111种特有成分,进一步挖掘利用的潜力巨大。
    贮藏·保鲜·加工
    甘薯淀粉加工废渣制备复合寡糖的条件优化及其活性评价
    董向艳1, 李静梅2, 石波1, 彭晴1, 乔宇1, OjokohEromosele1, 张迷敏1
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3044-3057.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.014
    摘要 ( 277 )   HTML ( 1 )   PDF (661KB) ( 328 )   收藏
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    【目的】探索商品化β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶共同水解甘薯淀粉加工废渣(简称甘薯渣)制备复合寡糖的最佳条件,并利用复合寡糖诱导大豆生成大豆抗毒素,为复合寡糖的工业化生产及应用提供科学依据。【方法】分别用商品化β-葡聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶水解甘薯渣,以温度、pH、底物浓度、酶添加量和反应时间为条件开展单因素试验,利用TLC和HPLC对酶解产物进行测定,分别以纤维二糖得率、果胶二糖和果胶三糖总得率为指标得到单因素试验的最佳条件,再通过复合酶共同水解甘薯渣制备复合寡糖,并对纤维寡糖、果胶寡糖以及复合寡糖这3种寡糖产物进行诱导大豆抗毒素活性评价。【结果】纤维寡糖制备的单因素试验结果表明,当温度40℃、pH3.5、底物浓度1%、β-葡聚糖酶添加量6.9×103 U•g-1甘薯渣膳食纤维、反应时间7 h时酶解效果最好,寡糖产物以纤维二糖为主,纤维二糖得率为100.6 mg•g-1(纤维二糖质量/甘薯渣膳食纤维质量),纤维二糖转化率为22.37%(纤维二糖质量/甘薯渣膳食纤维中纤维素质量)。果胶寡糖制备的单因素试验结果表明,当温度40℃、pH2.5、底物浓度1%、多聚半乳糖醛酸酶添加量1.42×104 U•g-1甘薯渣膳食纤维、反应时间4 h时酶解效果最好,寡糖产物以果胶二糖和果胶三糖为主,果胶二糖和果胶三糖总得率为17.43 mg•g-1(果胶二糖与果胶三糖的总质量/甘薯渣膳食纤维质量),果胶二糖和果胶三糖总转化率为29.9%(果胶二糖与果胶三糖的总质量/甘薯渣膳食纤维中果胶质量)。根据上述单因素试验结果优化复合寡糖制备条件,在温度40℃、pH2.5、底物浓度1%、β-葡聚糖酶添加量6.9×103 U•g-1甘薯渣膳食纤维、多聚半乳糖醛酸酶添加量1.42×104 U•g-1甘薯渣膳食纤维、反应7 h时,复合寡糖产物中以纤维二糖、果胶二糖和果胶三糖为主,纤维二糖得率为136.97 mg•g-1,纤维二糖转化率为33.57%;果胶二糖和果胶三糖的总得率为25.96 mg•g-1,果胶二糖和果胶三糖总转化率为44.53%,与单一寡糖制备结果相比均有明显提高。利用甘薯复合寡糖作为外源诱导剂诱导大豆生成大豆抗毒素,当复合寡糖浓度为1%,大豆在无菌水中浸泡5 h,诱导温度25℃、湿度50%、黑暗中培养4 d时,大豆抗毒素生成量达到最高,为1.21 mg•g-1干豆重。而在相同条件下纤维寡糖和果胶寡糖诱导得到的大豆抗毒素生成量分别为0.80和0.46 mg•g-1干豆重。结果表明,甘薯复合寡糖对大豆抗毒素的诱导效果优于单一寡糖。【结论】甘薯渣成本低廉,可作为制备复合寡糖的优良原料,试验得到制备复合寡糖的最佳工艺条件,以其制备的复合寡糖对大豆抗毒素的生成与积累具有极佳的效果。
    N-乙酰胞壁质酶缺失对保加利亚乳杆菌LJJ自溶及形态的影响
    崔文明, 逄晓阳, 张书文, 刘鹭, 李红娟, 吕加平
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3058-3068.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.015
    摘要 ( 269 )   HTML ( 1 )   PDF (684KB) ( 429 )   收藏
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    【目的】乳酸菌自溶在发酵乳制品生产中广泛存在,自溶的速率和程度可以对产品的质量、风味、生产周期产生重要影响,在整个发酵过程中非常重要。N-乙酰胞壁质酶作为肽聚糖水解酶中的重要组成,可以破坏细胞壁完整性,在乳酸菌自溶过程中发挥着重要作用。论文旨在研究N-乙酰胞壁质酶缺失对保加利亚乳杆菌自溶的影响及对其形态的影响。【方法】分别以保加利亚乳杆菌基因组和pMG36e载体为参考序列设计引物,PCR分别扩增保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的上下游同源臂基因m-up, m-down和pMG36e中的红霉素抗性基因。上述基因经过测序验证后,将经Kpn Ι,Xba Ι双酶切的红霉素抗性基因和pUC19相连接形成重组载体pUC:Emr并进行验证。随后,将经Kpn Ι,Sac Ι双酶切的m-down和重组载体pUC:Emr相连接形成重组载体pUC:Emr:m-down并进行验证。最后,将经Pst Ι,Xba Ι双酶切的 m-up与重组载体pUC:Emr:m-down相连接形成重组载体pUC:m-up:Emr:m-down并进行验证。以重组载体pUC:m-up:Emr:m-down作为N-乙酰胞壁质酶的同源重组敲除组件, 在电转化条件电压1.5 kV,电阻400 Ω和电容25 μF下,电转入保加利亚乳杆菌,在含有红霉素的MRS琼脂平板上筛选N-乙酰胞壁质酶基因敲除突变菌株并进行PCR验证。采用核酸溶出法检测基因缺失菌株与野生型菌株间的自溶度变化。扫描电子显微镜观察基因缺失菌株与野生型菌株间的形态变化。【结果】构建得到在N-乙酰胞壁质酶中间插入红霉素抗性基因为筛选标记的敲除组件用于保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的基因敲除。获得带有红霉素抗性基因的N-乙酰胞壁质酶缺失的保加利亚乳杆菌突变菌株。突变菌株相比野生型菌株自溶特性及形态均发生显著变化,其中自溶度显著降低,37℃下自溶24 h,野生型菌株的自溶度约为73%,而突变菌株的自溶度约为35%,自溶度降为原来的1/2。野生型菌株的单个菌体细胞长度约10 μm,突变菌株的单个菌体细胞约30—40 μm,相比野生型菌株约增长了3—4倍。【结论】N-乙酰胞壁质酶在保加利亚乳杆菌自溶与细胞分裂过程中起着重要作用。保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的缺失会导致菌体自溶的降低和菌体增殖过程中的细胞分裂受阻,产生菌体长度增长约3—4倍的菌体细胞。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    绵羊RARG基因在发情不同阶段卵巢中的mRNA表达
    王维民, 胡庭溪, 李发弟, 马友记, 樊红樱, 潘香羽
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3069-3076.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.016
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    【目的】分离鉴定绵羊视黄酸受体-γ(Retinoic acid receptor gamma,RARG)基因,分析该基因的分子特征,研究其在发情周期不同阶段卵巢中的表达差异。【方法】选取年龄和体况相近、健康的甘肃高山细毛羊周岁母羊8只,通过同期发情处理,根据卵巢生理状态,将其分为两组:黄体期组和卵泡期组,各4只,屠宰后,采集卵巢组织,以周岁母羊卵巢组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增绵羊RARG基因并克隆到pMD18-T载体中进行测序验证。利用ORF Finder和DNAStar等生物信息学软件分析绵羊RARG基因的理化性质、同源性和预测结构域和功能。利用Q-PCR技术,检测绵羊RARG基因在母羊发情周期不同阶段卵巢组织中的相对表达量,用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,探讨RARG基因对绵羊发情周期的调控机制。【结果】获得了绵羊RARG基因包含完整编码区序列在内的1 588 bp的绵羊RARG基因序列,并提交至NCBI,GenBank登录号为KF019682。该序列含有1个1 377 bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码458个氨基酸,其蛋白分子质量为50 955.8 D,理论等电点为7.45。绵羊RARG基因与牛、普通狨、家犬、仓鼠、家猫、人、小鼠、虎鲸、狒、家鼠、野猪、海牛、海豚和蟾蜍等14个物种的同源性分析,结果显示RARG基因在上述物种间高度保守,且与牛的亲缘关系较近,序列同源性最高。GO功能分析结果显示,绵羊RARG基因作为结构蛋白参与转录调控的几率最高,分别为0.272和0.223。在绵羊RARG基因编码的氨基酸序列上发现了2个功能结构域,分别是核激素受体c4锌指结构域(c4 zinc finger in nuclear hormone receptors,ZnF_C4)和 激素受体配体结构域(ligand binding domain of hormone receptors,HOLI)。Q-PCR结果显示,绵羊RARG mRNA 在甘肃高山细毛羊卵泡期卵巢中的相对表达量显著高于黄体期(P<0.05)。【结论】绵羊RARG基因在物种间高度保守,含有ZnF_C4和HOLI等2个与转录调控相关的功能结构域,推测该基因可能作为一种重要的转录因子参与母羊发情周期调控。
    豆状带绦虫TPO18基因的原核表达及保护性分析
    韩进欢, 苟惠天, 尚清炎, 孙晓林
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3077-3084.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.017
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    【目的】明确重组蛋白 pGEX-TPO18 的免疫保护效果。【方法】提取豆状带绦虫六钩蚴 RNA,根据带科其他种属绦虫 18 kD 基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR 扩增,产物克隆于 pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的 PCR 产物和质粒 pGEX-4T-1 分别用 EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至 E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过 PCR 方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为 pGEX-TPO18。用 IPTG 诱导表达重组质粒,收集菌体进行 SDS-PAGE 分析,用 GST 琼脂糖树脂纯化 TPO18 蛋白,进行 Western blottting 检测。将纯化后的重组蛋白分别乳化弗氏佐剂、206 佐剂、氢氧化铝佐剂后免疫家兔,每次 50 μg/只,共免疫 3 次,末次免疫后 34 d 每只家兔感染 1 500 个虫卵,感染 58 d 后扑杀并计算各免疫组减囊率。免疫前后每隔 7 d 采血分离血清,ELISA 法检测血清抗体水平,以 40 µg•mL-1重组蛋白包被酶标板,血清 1﹕200 稀释,检测血清样品的 OD492nm 值。【结果】TPO18 基因的 RT-PCR 扩增产物为 339 bp, 与预期大小相符;测序结果表明无碱基突变,重组质粒pGEX-TPO18构建成功。pGEX-TPO18 在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为 38.6 kD 的可溶性蛋白,Western blotting分析结果显示兔抗豆状囊尾蚴阳性血清与重组蛋白在38.6 kD处有一条明显的反应条带,表明该重组蛋白具有反应原性。经ELISA检测,免疫后7 d 免疫组家兔抗体水平开始升高,第43 天达到峰值。经口感染虫卵后,免疫组抗体水平开始降低,但仍保持一定水平。家兔免疫保护试验表明弗氏佐剂、206 佐剂和氢氧化铝佐剂免疫组减囊率分别为 79.13%、65.66% 和 50.43%。【结论】研究表明弗氏佐剂免疫效果较好,有望研制出抗豆状囊尾蚴病的高效疫苗。
    家蚕免疫负调控分子BmFAF的功能
    马晓娟, 李亚明, 胡翠美, 王菲, 夏庆友
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3085-3093.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.018
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    【目的】在细胞和个体水平上探讨家蚕BmFAF的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫稳态提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmFAF并进行结构域预测和分析;利用荧光定量PCR检测BmFAF在家蚕各龄期以及5龄第3天幼虫的各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;构建BmFAF的细胞表达载体以及合成用于RNAi的dsRNA,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmFAF或降低BmFAF的表达水平,并利用Western blotting或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化;通过注射dsRNA在个体中降低BmFAF的表达水平,并检测BmFAF对抗菌肽基因表达水平和家蚕感染细菌后存活率的影响。【结果】BmFAF与其他物种FAF家族成员有较高的同源性,与人类HsUBXD8、HsFAF1和果蝇DmCaspar分别具有60%、42%和47%的相似性,并具有保守的UBX结构域。时空表达特征分析表明,除生殖腺外,BmFAF在免疫组织中表达量略高于其他组织,眠蚕期表达量显著高于起蚕期,尤其在2龄和3龄眠蚕中的表达量最高;5龄时BmFAF的表达量普遍较低,而从5龄发育至预蛹期时,BmFAF的表达水平有所上升。免疫诱导表达谱显示,家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或黏质沙雷氏菌0.5 h后,脂肪体中BmFAF的表达水平即显著下降,且在12 h内没有恢复,而抗菌肽BmCecropinA1的表达则持续上升,并在12 h时达到最高。在BmE细胞中过表达BmFAF,抗菌肽BmCecropinA1、BmAttacin和BmMoricin的表达水平与转染对照质粒的细胞中的抗菌肽相比,均显著降低。在细胞中转染dsRNA后,BmFAF的表达水平被有效地降低50%—60%,抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin的表达水平与对照相比均显著升高。对5龄第2天家蚕幼虫注射dsRNA,24 h后通过荧光定量PCR检测到BmFAF的表达水平在注射dsFAF的家蚕中下降至注射dsEGFP对照中的45%;而抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin、BmAttacin的表达水平均被显著上调。这些家蚕通过注射感染黏质沙雷氏菌24 h后,死亡率即低于对照组,在感染72 h后仍有40%左右的家蚕存活,而对照组中则无家蚕存活。【结论】结构分析、表达特征以及细胞和个体水平上的功能研究表明,BmFAF是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制抗菌肽的表达维持家蚕免疫稳态, 而降低BmFAF的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,从而有助于减缓甚至避免家蚕在感染细菌后的死亡。
    研究简报
    拟南芥PMRP的表达特性及功能分析
    张昊, 由诗东, 高静, 张海丽, 李生辉, 邢继红, 王凤茹, 董金皋
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3094-3102.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.019
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    【目的】分析拟南芥中功能未知基因PMRP(putative membrane related protein)的表达特性;明确PMRP在调控拟南芥生长发育过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,寻找拟南芥中与PMRP含相同结构域的基因,并绘制进化树;利用Real-time PCR技术分析PMRP在生长8和21 d的拟南芥根、茎中的相对表达量,比较生长21 d的拟南芥第1、2、3、4对莲座叶及茎生叶中PMRP的表达情况,分析花器官的萼片、花瓣和雄蕊及生长后期拟南芥种子中PMRP的表达量的高低;构建35S::PMRP过表达载体,转化Columbia野生型拟南芥,通过RT-PCR技术验证PMRP的表达量,获得过表达PMRP的转基因植株;通过对过表达PMRP的转基因拟南芥的表型观察,分析PMRP对拟南芥叶片发生、茎的生长部位等的调控作用;通过对过表达PMRP转基因拟南芥茎秆横切面的石蜡切片观察,分析PMRP在茎秆维管束木质部和韧皮部分化过程的作用;通过对花器官的解剖学观察,明确PMRP对拟南芥花器官生长发育的影响;通过对过表达PMRP转基因拟南芥果荚形成的观察,分析PMRP对拟南芥育性的影响。【结果】PMRP是一个含有START保守域的411个氨基酸的蛋白质,具有跨膜结构域,在拟南芥中含有START结构的基因共35个;Real-time PCR结果表明,PMRP在茎生叶中表达量最高(相对表达量约为2 935)、莲座叶中次之,且莲座叶生长时间越长,PMRP的表达量越多(PMRP在第1、2、3、4对莲座叶中的相对表达量分别约为1 650、1 113、734、507),然后是花器官中的萼片(PMRP相对表达量约为937),PMRP在茎、根、种子中都有的表达,但相对表达量都低于270;PMRP在花器官中雄蕊的相对表达量最低(约为64),远远低于同属花器官的萼片中PMRP表达量(937),PMRP在根、茎中的表达量随生长时间的增加而增加,PMRP在8和21 d的根中相对表达量分别为154和222,PMRP在8和21 d的茎中相对表达量分别为200和264;过表达PMRP转基因拟南芥表现为在枝条上产生莲座叶,茎秆容易倒伏,维管束没有明显的形成层,且木质部和韧皮部排列紊乱,花器官中雄蕊的花丝变短,形成的角果数量减少,育性降低。【结论】START结构域在功能上极度保守;PMRP在拟南芥不同组织器官均有表达,且随着时间的延长,PMRP的表达量也增加,但在花器官的雄蕊表达最低,一旦过表达PMRP,拟南芥花器官的雄蕊发育异常,造成育性降低;PMRP对拟南芥的叶片发生、茎秆维管束分化和花器官发育具有重要作用。
    苹果褐斑病潜育动态
    雍道敬, 李保华, 张延安, 王彩霞, 董向丽, 郭长飞
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3103-3111.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.020
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    【目的】褐斑病是导致苹果早期落叶的主要病害。研究旨在通过调查褐斑病的流行规律,为制定综合防治方案提供理论依据。【方法】2011和2012年,将褐斑病菌(Diplocarpon mali)分生孢子悬浮液分4—6次喷雾接种于富士苹果各龄期的叶片,接种后观测记录每个接种叶片第1个病斑出现的时间,每3 d观测一次,依此计算褐斑病在富士叶片上的平均潜育期、最短潜育期和显症历期。接种期间用全自动气象站,每30 min记录接种苹果树附近的气温、降雨量和相对湿度。【结果】苹果褐斑病在富士苹果叶片上的平均潜育期23.8 d;最短潜育期为8—20 d,平均为13.6 d;显症历期为12—54 d,平均为31.3 d。在显症历期内,不同的时期显症病斑数不同。6、7月份接种叶片比8月份接种叶片的最短潜育期和显症历期长。防雨棚内培育叶片的最短潜育期和显症历期长于自然条件下培育的叶片的最短潜育期和显症历期。苹果褐斑病在基部老龄叶片上潜育期短,在代谢旺盛的梢部叶片上潜育期长。苹果生长前期(6、7月份)接种叶片的潜育期显著的长于生长后期(8、9月份)接种叶片的潜育期。【结论】苹果褐斑病的显症是一个动态的过程,其潜育时间和显症历期都相对较长。除取决于病原与寄主的组合外,苹果褐斑病潜育时间和显症历期的长短主要受叶片龄期、衰老程度和生理状态,即叶片抗病性的影响。6—9月份是苹果褐斑病的主要发病期,在此期间气温对褐斑病潜育期的影响不大,而降雨和高湿能促进病斑显症。在褐斑病菌侵染后的15 d,甚至20 d内,使用内吸治疗性杀菌剂能抑制绝大部分潜育期病斑发病。
    玫瑰与月季种间杂交障碍原因分析
    于晓艳1, 邢树堂2, 赵兰勇1
    中国农业科学. 2014, 47(15):  3112-3120.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.021
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    【目的】探明玫瑰(Rosa rugosa)与月季(Rosa hybrid)种间杂交障碍原因,为提高观赏玫瑰育种效率提供理论依据。【方法】以牟平野生玫瑰(MP)、‘唐红’玫瑰,以及月季品种‘塞尔维亚’和‘红帽子’为试材,统计分析种间杂交(MPב塞尔维亚’、MPב红帽子’)和品种间杂交(MPב唐红’)的田间坐果率、每果种子数、种子纵径、有胚率、萌发率和成苗率;采用荧光显微法观察花粉管在花柱中的生长状况;利用常规石蜡切片观察受精及胚胎发育状况。【结果】(1)MPב塞尔维亚’种间杂交坐果率和每果种子数均显著低于品种间杂交,MPב红帽子’种间杂交则未结籽。(2)MPב塞尔维亚’种间杂交种子大小不一,76.67%的小种子纵径仅(0.24±0.07)cm,无胚、胚乳,不萌发;23.33%的大种子纵径达(0.61±0.05)cm,有胚、胚乳,萌发率和成苗率显著低于品种间杂交。(3)授粉后2 h,种间杂交花粉和品种间杂交花粉均已在柱头上大量萌发,但种间杂交花粉管顶端却大量沉积胼胝质;授粉后20—24 h,品种间杂交花粉管进入子房,但全部MPב红帽子’花粉管和多数MPב塞尔维亚’花粉管却于花柱1/2处停止生长;品种间杂交花柱通道细胞及间隙中无明显胼胝质沉积,但种间杂交花柱通道细胞及间隙中却大量沉积胼胝质。(4)少量MPב塞尔维亚’花粉管能够进入子房,并完成受精。但79.42%的杂种胚在授粉15 d左右的心形胚阶段败育,20.58%的杂种胚仍能继续发育。【结论】(1)MPב红帽子’为受精前障碍,MPב塞尔维亚’为受精前后双重障碍;(2)受精前障碍主要由花粉管在花柱1/2处停止生长而导致,可能与花粉管顶端和花柱通道细胞及间隙中大量沉积的胼胝质有关;(3)受精后障碍主要由杂种胚在心形胚阶段败育而造成。