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当期目录

    2014年 第47卷 第10期 刊出日期:2014-05-20
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    小麦TaSnRK2.10的多态性及与农艺性状的关联
    王倩1, 2, 毛新国2, 昌小平2, 贾继增2, 刘惠民1, 景蕊莲2
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1865-1877.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.001
    摘要 ( 309 )   HTML ( 1 )   PDF (743KB) ( 627 )   收藏
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    【目的】蔗糖非发酵蛋白激酶(SnRK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物信号传递途径中发挥着重要作用。研究小麦TaSnRK2.10的多态性,开发其功能标记,并进行标记-表型性状关联分析,为利用分子标记进行遗传改良和种质创新提供依据。【方法】以30份多态性较高的六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,通过测序分析TaSnRK2.10-A的序列多态性;利用中国春缺-四体材料对该基因进行染色体定位;利用RIL群体(偃展1号×内乡188)对基因进行遗传定位;根据TaSnRK2.10-A序列多态性,开发分子标记,以262份普通小麦构成的自然群体为材料分析基因单倍型与表型性状的关联特性。【结果】克隆了小麦TaSnRK2.10的A、D基因组序列,在由30份多态性较高的小麦材料组成的自然群体中,没有检测到来自D基因组的TaSnRK2.10-D序列多态性;TaSnRK2.10-A全长4 688 bp,包括启动子1 934 bp、5′-UTR 343 bp、编码区2 319 bp及3′-UTR 92 bp。在基因全长序列中共检测到15个SNP、2个InDel。其中,启动子区有8个SNP,5′-UTR有2个,编码区有5个。位于编码区的5个SNP中,2个存在于外显子,其中一个是非同义突变。2个InDel均位于编码区。根据序列多态性分别设计了启动子区的分子标记PM1和PM2,以及基因编码区的分子标记GM1和GM2。利用中国春缺-四体材料将TaSnRK2.10-A定位于小麦染色体4A,利用RIL群体将TaSnRK2.10-A定位在染色体4A的标记Xwpt7001和WMC48之间,与2个侧翼标记的遗传距离分别为5.1 cM和25.7 cM。利用开发的4个分子标记,将自然群体的262份材料分为4种单倍型,分别与千粒重、单株穗数和每穗小穗数显著相关或极显著相关,HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型。4 184 bp位点为C时,为高千粒重的优异等位变异。【结论】小麦TaSnRK2.10-A位于染色体4A。HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型,HapⅣ是提高单株穗数的优异单倍型,4 184 bp位点的胞嘧啶(C)是优异等位变异。
    人工劣变处理对玉米种胚差异基因表达的影响
    杨伟飞, 张景龙, 吕伟增, 曹广灿, 陈军营
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1878-1893.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.002
    摘要 ( 261 )   HTML ( 1 )   PDF (788KB) ( 670 )   收藏
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    【目的】利用数字基因表达谱技术(digital gene expression tag profiling,DGE)探索人工控制劣变(controlled deterioration treatment,CDT)条件下玉米种胚差异基因的表达变化,为揭示种子劣变的分子机理提供依据。【方法】以玉米杂交种郑单958种子为材料,采用高温(45℃)高湿(相对湿度100%)方法处理72 h,以未处理材料为对照,利用DGE分别进行高通量测序,测序结果与参考基因组和参考基因数据库比对获得表达基因,利用RPKM(Reads Per Kb per Million reads)方法计算基因的表达量,根据FDR(false discovery rate)<0.001和|log2 ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因,对获得的差异表达基因(digital expression genes,DEGs)进行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库功能注释,并对注释结果进行富集分析处理。【结果】对照玉米种胚中检测到32 000多种mRNAs。CDT处理后差异表达基因有4 713个。其中上调表达2 874个,下调表达1 839个。GO富集分析表明,这些基因涉及细胞组分、分子功能和生物学过程方面,其编码的蛋白主要分布在细胞器和细胞膜上,参与能量代谢、信号转导、刺激响应和衰老死亡等过程,具有结合、催化和抗氧化等功能。这些基因中,能被KEGG数据库注释的有2 470个,参与了288条代谢通路,其中有16条通路存在着显著性富集。这些通路中,参与能量代谢的基因共有113个,分别参与糖酵解/糖异生过程(59个)、磷酸戊糖途径(31个)和丙酮酸代谢过程(50个);其中,调节糖酵解/糖异生过程的烯醇化酶基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因等、丙酮酸代谢中的丙酮酸激酶基因等和磷酸戊糖途径中的α-L-岩藻糖苷酶基因等上调幅度最大。还发现,调节NADH代谢相关的基因有25个(9个上调,16个下调);NADPH代谢的有10个(4个上调,6个下调)。这些基因的表达变化能够调节活性氧的产生和积累。【结论】DGE可以作为研究种子劣变和活力丧失的有效手段。CDT能够影响玉米种胚差异基因的表达,进而影响细胞能量代谢相关过程,主要表现在糖酵解途径受到抑制,导致ROS产生和积累,从而加速玉米种胚细胞的衰老及死亡,最终造成种子的劣变和活力丧失。在这个过程中,差异表达基因可能扮演重要角色。
    基于基因组的绒毛状烟草和林烟草microRNA及其靶基因分析
    李凌1, 2, 张磊3, 晁江涛1, 龚达平1, 李凤霞1, 王倩1, 丁安明1, 2, 陈雅琼1, 2, 孙亭亭1, 2, 孙玉合1
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1894-1903.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.003
    摘要 ( 260 )   HTML ( 1 )   PDF (630KB) ( 600 )   收藏
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    【目的】填补绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和林烟草(Nicotiana sylvestris)在miRNA相关领域的研究空白,揭示普通烟草(Nicotiana tabacum)的生长发育调控机理。【方法】在绒毛状烟草和林烟草全基因组中预测并分析miRNA及其靶基因,通过同源比对及miRNA前体二级结构特征进行预测:参考序列在绒毛状烟草和林烟草基因组的比对中,允许最多1—2个错配;miRNA二级结构为经典茎环结构,其中MEF最大值为-25,MEFI最小值为0.85,预测的miRNA与已知的同一家族的miRNA位于发夹结构的同一条臂上;去除E值小于等于1e-6的编码蛋白的序列。【结果】在绒毛状烟草中得到39个家族的162条miRNA,包括14对正/反义miRNA和5个基因簇。在林烟草中得到40个家族的169条miRNA,包括13对正/反义miRNA和3个基因簇。2个野生烟草在保守度高的miRNA家族中,其成员分布相似,且成员数相近。在保守度相对较低的家族中,2个野生烟草其成员分布差异较为明显,其中,miR5021、miR5203等9个家族仅在绒毛状烟草中有成员,miR1446、miR1509等10个家族仅在林烟草中有成员。2种野生烟草的正义miRNA与反义miRNA都有着1—4个碱基差异,这些差异位点在不同的家族中呈现出偏好性,而且在2种野生烟草中偏好性相似:miR164家族的9、12、13个碱基处,miR172家族的1、21个碱基处,miR396家族的2、17个碱基处,miR399家族的15、20个碱基处。2种野生烟草的基因簇主要是由miR156、miR169家族组成,其前体的间距小于350 nt,同时在绒毛状烟草中首次发现miR6019/miR6020基因簇。以普通烟草的unigene数据库作为靶基因集进行预测与分析,在绒毛状烟草122条miRNA中得到749个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因206条,其中89条(43%)得到GO功能注释;在林烟草中117条miRNA得到650个靶基因,去掉重复基因得到非冗余靶基因169条,其中78条(46%)得到GO功能注释。在分子功能方面,大多数靶基因具有结合等活性。在生物学过程中,靶基因主要参与了发育过程、生殖过程、多细胞器官发育过程、胁迫应答过程等。【结论】控制发育和多细胞器官发育过程的靶基因数方面以林烟草居多,而胁迫应答的靶基因数以绒毛状烟草较多。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    近20年东北气候变暖对春玉米生长发育及产量的影响
    陈群, 耿婷, 侯雯嘉, 陈长青
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1904-1916.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.004
    摘要 ( 292 )   HTML ( 1 )   PDF (617KB) ( 977 )   收藏
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    【目的】探求东北三省近20 年气候变暖对春玉米生长发育进程及产量的影响,为东北地区气候变暖下粮食安全问题提供理论依据。【方法】选取东北黑龙江、吉林和辽宁省三省进行区域研究,利用东北地区近20 年气候观察数据和春玉米长期观测数据,通过相关和回归等数理统计方法系统分析东北三省春玉米生长季的气候因子(温度和降水量)与春玉米生育进程数据和历史产量数据之间的关系。【结果】东北地区1989—2009 年春玉米生长季日最高温度、最低温度以及平均温度均呈明显上升趋势,气候倾向率每年分别为0.050、0.045和0.044℃,表现为春玉米生育期间白天增温幅度较夜间增温幅度大,降水量变化不显著。近20 年黑龙江省各试验站平均播种日期变化趋势是每年提前0.10 d,而吉林省、辽宁省各试验站每年分别推迟0.18和0.21 d。黑龙江省、吉林省以及辽宁省各试验站春玉米平均成熟日期变化趋势分别每年推迟0.39、0.35和0.55 d,平均生育期天数变化趋势分别每年增加0.49、0.17和0.34 d,成熟日期推迟的幅度大于播种日期的推迟幅度导致三省试验站春玉米生育天数增加。对1991—2006 年东北地区审定品种生育期数据与气候数据关系进行相关性分析表明,黑龙江省最高温度(Tmax)上升会延长审定品种生育期,而吉林和辽宁省春玉米的审定品种生育期与平均温度(Tavg)、最高温度(Tmax)和最低温度(Tmin)均呈现为正相关。采用T检验法分析春玉米审定品种生育期和试验站春玉米生育期关系表明,黑龙江和辽宁省的审定品种和试验站春玉米生育天数呈一致的增加趋势,且无显著性差异。采用线性偏回归测验法分析品种和气候因子对春玉米生育期影响重要性的结果表明,品种生育期的延长是导致春玉米生育期不断延长的主要原因。三省春玉米近20 年平均产量表现为增加趋势,其趋势由小到大的次序是辽宁省、吉林省以及黑龙江省,越往北其产量增加趋势越大,产量增加越明显。东北各省地级市1989-2009年面板数据分析表明,东北地区平均温度(Tavg)、最高温度(Tmax)和最低温度(Tmin)的变化均会影响春玉米的产量。温度上升,东北部产量增加明显,尤其是黑龙江省东部的三江平原地区,而东北地区西南部减产。【结论】受气候变暖的影响,东北春玉米品种对气候变暖是逐步适应,可以利用其适应潜力,通过春玉米品种改良和调整播期等措施来适应气候变暖,从而提高春玉米产量。
    辽西半干旱区垄膜沟种方式对春玉米水分利用和产量的影响
    肖继兵1, 孙占祥2, 蒋春光1, 刘志1, 郑家明2, 冯良山2
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1917-1928.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.005
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (720KB) ( 578 )   收藏
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    【目的】春玉米是辽西地区的主要作物,其整个生育期需水量较多,但该区降水资源短缺且降水变率大,时空分布不均,有限降水难以满足春玉米高产稳产所需。垄膜沟种可有效汇集天然降水,提高降水资源化程度,开展相关研究以充分有效地利用该区有限的自然降水,提高农田水分利用效率,促进玉米稳产高产。【方法】2007—2013年在辽宁朝阳地区进行玉米垄膜沟种微集雨种植试验,研究不同种植模式对土壤水分、玉米产量和农田水分利用效率的影响。试验设垄膜沟种(沟内不覆盖,T1)、垄膜沟覆秸秆(T2)、垄膜沟覆膜(T3)和传统种植(CK)4种处理,随机区组设计,3次重复。传统种植为垄沟种植,行距50 cm,垄膜沟种方式为沟垄相间排列,沟宽80 cm,垄宽40 cm,垄高15 cm,垄上覆膜为集雨区,沟为种植区,种植2行玉米。各处理种植密度为52 500株/hm2左右,种肥为磷酸二铵(375 kg•hm-2,N 18%,P2O5 46%),拔节初期追施尿素(375 kg•hm-2,N 46%)。【结果】垄膜沟种微集雨种植可有效汇集天然降雨,2009年和2010年玉米出苗率分别提高13.0%和14.9%,出苗时间提前1—2 d。前期长时间无有效降雨的情况下,一场有效降雨过后,土壤贮水量增加幅度依次为T2>T1>CK>T3,T1和T2种植区水分入渗深度至少达到60 cm,而CK水分入渗深度只有40 cm,产流效率为61%,T1和T2蓄墒增加率分别为72%和88%。各处理生育期间土壤水分平均值从大到小依次为T2>T1>T3>CK,其值分别为140.93、135.27、127.85和118.98 mm,较对照分别增加18.45%、13.69%和7.46%。2007—2013年,T1—T3产量比对照分别增产24.31%—32.58%、9.95%—17.81%、32.12%—37.16%、16.58%—27.96%、2.50%—9.40%、10.85%—29.33%和4.14%—17.95%,T1、T2和T3较对照平均增产幅度分别为14.52%、20.01%和23.44%。2007—2012年,T1—T3水分利用效率较对照分别增加24.66%—36.07%、14.12%—23.73%、38.34%—53.89%、29.07%—35.68%、1.20%—19.60%和9.02%—32.55%,T1、T2和T3水分利用效率较对照平均增加幅度分别为20.39%、27.94%和28.02%。在相对干旱年份,产量和水分利用效率增加幅度较大。【结论】通过连续7年进行旱作农田垄膜沟种微集雨种植试验,明晰了该技术模式在辽西半干旱地区的集雨、蓄水和保墒效果,有效减轻春季干旱对春播保苗和幼苗生长造成的不利影响,丰富了辽西半干旱地区旱作集水农业的理论基础。通过该项技术的推广应用,可有效提高该区降水资源利用率和农田水分利用效率,使玉米稳产高产,从而促进该区旱作农业健康、可持续发展。该项研究对中国北方旱作集水农业的发展也具有重要的借鉴意义。
    盆栽条件下土壤无机氮浓度对大豆结瘤、固氮和产量的影响
    严君, 韩晓增
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1929-1938.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.006
    摘要 ( 236 )   HTML ( 1 )   PDF (526KB) ( 427 )   收藏
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    【目的】大豆结瘤固氮和产量对氮肥的反应不同,实际上是由于大豆共生固氮系统及其根系系统对土壤无机氮浓度的感知不同造成的。通过对不同土壤无机氮浓度下大豆结瘤、固氮及产量影响的研究,探索能提高大豆产量、结瘤和固氮的土壤无机氮浓度,即掌握土壤无机氮浓度与大豆共生固氮和产量的数量关系,为调控氮肥施用量及施用时期、预测氮肥对大豆共生固氮能力和产量的影响提供理论依据。【方法】采用盆栽土培试验方法,分别在第一片复叶充分生长(V2期)、始花期(R1期)、始荚期(R3期)和始粒粒(R5期)一次性施用不同量的氮肥,从而形成不同无机氮浓度的土壤。利用获得的不同无机氮浓度土壤为供试土壤,对各生育时期根瘤数量、干重和固氮酶活性及成熟期产量及其构成因子进行调查,明确大豆根瘤固氮和产量对土壤无机氮浓度的响应,掌握土壤无机氮浓度与氮肥及与大豆固氮和产量的数量关系。【结果】不同时期土壤无机氮浓度处理下的根瘤干重、数量和固氮酶活性均随着大豆生育时期的推进在R4期时达到最大值。R6期时大豆平均根瘤干重、数量和固氮酶活性均表现为:V2期>R5期>R3期>R1期,较CK处理根瘤平均干重分别下降15%、18%、17%和32%;根瘤数量下降13%、18%、19%和20%;固氮酶活性下降19%、22%、23%和32%。不同生育时期土壤无机氮浓度与R6期大豆根瘤干重、数量和固氮酶活性间均具有显著的线性负相关关系,即土壤无机氮浓度越大对根瘤干重、数量和固氮酶活性的抑制作用越大。大豆干物质积累量和产量的变化趋势均表现为:R1期>R3期>V2期>R5期。除R5期不同土壤无机氮浓度处理与CK处理间的生物量和产量差异不显著外,V2、R1和R3期不同土壤无机氮浓度处理,均显著地促进大豆生物量和产量的增加。不同生育时期处理均以N3和N4处理的生物量、株高、株荚数、株荚重、株粒重显著高于其它处理。V2期土壤无机氮浓度对大豆固氮能力和产量的影响最大,而R1期土壤无机氮浓度对大豆生长和产量的影响最大。不同生育时期不抑制大豆固氮同时还提高大豆产量的土壤无机氮浓度不同:V2期土壤无机氮浓度达到135.8 mg•kg -1;R1期土壤无机氮浓度为58—91 mg•kg-1;R3期土壤无机氮浓度为29.4—62.8 mg•kg -1;在R5期土壤无机氮浓度达到102.3 mg•kg -1。【结论】大豆对氮肥的反应主要取决于土壤无机氮浓度的大小,而土壤无机氮浓度大小的调节,除了与氮肥施用量有关外还与大豆的生育时期有关系,可以根据农业生产和科学试验的需要进行调节。其中V2期土壤无机氮浓度对大豆根瘤数量、干重和固氮酶活性的影响大于其它生育时期土壤无机氮浓度处理;而R1期土壤无机氮浓度对大豆生物量和产量的影响大于其它生育时期土壤无机氮浓度处理。
    植物保护
    烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析
    赵艳琴1, 2, 吴元华1, 赵秀香1, 陈建光1, 伏颖1, 安梦楠1
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1939-1946.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.007
    摘要 ( 210 )   HTML ( 1 )   PDF (715KB) ( 422 )   收藏
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    【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶(endo polygalacturonases,endoPGs)是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框(ORF)长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作(接种)之后该基因的表达与未互作(不接种)的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】 烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。
    橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1的克隆及其表达模式解析
    申光茂, 豆威, 王进军
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1947-1955.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.008
    摘要 ( 217 )   HTML ( 1 )   PDF (672KB) ( 409 )   收藏
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    【目的】在克隆获得橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)1条羧酸酯酶基因全长序列的基础上,解析该基因在橘小实蝇不同发育阶段和组织以及经高效氯氰菊酯饲喂后的表达模式。同时结合之前完成的有关橘小实蝇羧酸酯酶生化特性以及增效剂处理研究结果,综合分析橘小实蝇羧酸酯酶对高效氯氰菊酯作用的应激反应,为明确羧酸酯酶对菊酯类杀虫剂的解毒代谢机制奠定基础。【方法】通过同源序列比对的方法,从橘小实蝇转录组数据中筛选出1条羧酸酯酶基因序列片段,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增得到该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,阐明其分子生物学特征。此外,分别提取橘小实蝇不同发育阶段以及3龄幼虫的中肠、脂肪体、马氏管和气管等组织的RNA,在内参基因稳定性评估筛选的基础上,运用qPCR的方法解析该基因在不同发育阶段和组织间以及药剂处理后的表达模式。【结果】从橘小实蝇转录组数据库中筛选出1条长度为1 028 bp的羧酸酯酶基因片段,通过对5′端和3′端进行RACE扩增分别得到长度为1 073和625 bp的目的片段,经序列拼接和验证后,确定该基因全长为1 872 bp,完整开放阅读框1 710 bp,编码569个氨基酸,推测其蛋白质分子量为63.3 kD,理论等电点6.38。该基因经序列比对命名为BdCAREB1,GenBank登录号为KF539980。基于最大似然法构建的系统发育树显示,该基因编码的蛋白质与双翅目昆虫的羧酸酯酶具有高度的同源性。分析其在不同发育阶段的表达模式发现,BdCAREB1在3龄幼虫期的表达量最高,其次为成虫期,而在卵期的表达量最低。在橘小实蝇3龄幼虫不同组织间的定量分析结果表明,BdCAREB1在脂肪体中表达水平最高,其次在中肠和马氏管的表达水平较低且接近,而在气管的表达量最低。经饲喂0.33 μg?g-1(药剂/饲料)的高效氯氰菊酯后检测BdCAREB1在整虫及组织间的表达情况发现,该基因在幼虫以及脂肪体中的表达量显著上调。【结论】橘小实蝇BdCAREB1的表达具有发育阶段和组织特异性,在幼虫期和脂肪体的表达量最高,并对高效氯氰菊酯处理表现出明显的应激反应,具有可诱导性。结合此前完成的橘小实蝇羧酸酯酶活性测定及增效剂研究结果,分析该基因很可能参与橘小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢。
    飞蝗3个细胞色素P450基因的分子特性及功能
    任晓宇, 杨美玲, 高翠娥, 张建珍, 马恩波
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1956-1965.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.009
    摘要 ( 227 )   HTML ( 1 )   PDF (1113KB) ( 306 )   收藏
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    【目的】研究飞蝗(Locusta migratoria)细胞色素P450(CYP450)第四家族(CYP4)中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用 RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1(GenBank登录号: KF857162、KF857163和KF857164)。采用实时定量 PCR 技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量 PCR 技术检测基因的沉默效率。应用农药点滴技术测定2龄若虫期飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的毒力,通过SPSS软件分析得出3种杀虫剂的LC30,同时应用该技术研究dsRNA干扰过的飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得了飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,其中CYP4C69开放阅读框1 518 bp,编码506个氨基酸;CYP4C73开放阅读框1 521 bp,编码 507个氨基酸;CYP4DH1开放阅读框1 512 bp,编码 504个氨基酸。对飞蝗不同龄期定量PCR结果分析,发现CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期,CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高;不同组织的定量PCR结果表明CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达,CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。通过RNA干扰,发现CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均可以被显著沉默。马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯对2龄若虫期飞蝗的毒力测定表明2龄若虫期飞蝗对3种杀虫剂的LC30剂量,分别为59.438、8.215、0.759 μg•mL-1。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性试验结果表明,双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后,飞蝗点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比,没有显著提高。【结论】获得飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,这些基因均可被双链RNA干扰而沉默,但CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1沉默后,飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性与对照组相比没有显著提高。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    滴灌施肥对免耕冬小麦水分利用及产量的影响
    陈静1, 2, 王迎春1, 李虎1, 王立刚1, 邱建军1, 肖碧林1
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1966-1975.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.010
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    【目的】为解决黄淮海平原麦区冬小麦滴灌用水量和合理的水肥配合等问题,以山东省桓台县免耕农田为试验点,系统研究了滴灌施肥对土壤水分垂直运移、冬小麦产量及其构成因素、水分利用效率等的影响。【方法】采用测墒补灌和生育期滴灌施肥相结合的方法,以常规漫灌施肥处理为对照。设置65 mm(W1)、98 mm(W2)、130 mm(W3)、195 mm(W4)和260 mm(W5)5个滴灌梯度水平处理。在130 mm滴灌水平下,分别于冬小麦的分蘖期、拔节期、孕穗期、扬花期和灌浆期5个生育时期设置相应的氮磷钾肥料配比,采用氮磷钾3个因素,每个因素4个水平的二次饱和D-最优设计方法进行田间试验。氮、磷、钾4个水平分别为:0水平(0、0、0),1水平(94.5、42.4、59.2 kg•hm-2),2水平(189、84.7、118.3 kg•hm-2)和3水平(270、121、169 kg•hm-2)。【结果】测墒补灌试验结果表明,W1、W3和W5处理滴灌后土壤水分主要向下运移至60、80和100 cm以下土层。滴灌量越大,土壤水分垂直运移深度越大。滴灌量260 mm时存在灌溉水深层渗漏的风险;W1处理在整个生育期土壤含水量明显低于其他滴灌处理,滴灌量130 mm以上的处理,整个生育期0—80 cm土层的含水量为田间持水量的75%—80%;滴灌施肥处理与常规漫灌施肥处理相比显著增加了冬小麦的有效穗数,不同滴灌处理中灌溉量与穗粒数呈正相关关系,与千粒重呈负相关关系;滴灌量130 mm时,小麦籽粒产量最高;滴灌显著提高了冬小麦的水分利用效率,并以W3处理最高,达2.28 kg•m-3;对滴灌施肥试验的拟合结果表明,试验区冬小麦最佳N、P2O5和K2O施用量分别为206.63、86.72和88.07 kg•hm-2。【结论】在黄淮海平原地区免耕冬小麦采用测墒补灌和滴灌施肥相结合的方法可以显著提高水分利用效率和小麦籽粒产量,较常规对照分别提高了57.46%和21.13%。主要原因是滴灌后水分向下运移至作物根区内,减少了灌溉水深层渗漏的风险,促进了作物对随水施入肥料的吸收。合理的滴灌施肥配比下总体可节水51.85%,节约氮肥23.47%、磷肥28.33%和钾肥47.89%。
    冬种绿肥对早稻产量及稻田杂草群落的影响
    陈洪俊, 黄国勤, 杨滨娟, 王晓维
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1976-1984.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.011
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    【目的】综合评价南方稻区不同冬季绿肥种类种植下水稻生长动态及稻田杂草群落效应,进一步优化稻田种植模式,大力发展冬季作物种植与开发。【方法】从2011年冬开始,在南方双季稻区江西农业大学科技园,采用田间试验,分别选取豆科、禾本科、十字花科冬季绿肥种类,比较冬季绿肥紫云英、油菜、黑麦草及混播绿肥(紫云英×油菜×肥田萝卜)对后作早稻产量及产量构成、干物质生产特性、稻田杂草群落的差异变化。【结果】紫云英前茬处理的早稻(紫云英—早稻—晚稻,MV-R-R)分蘖盛期、孕穗期、抽穗期和成熟期的群体干物重均明显高于其他处理,分别高出14.46%、10.99%、11.83%和7.23%,相应地其产量也分别比黑麦草—早稻—晚稻(RG-R-R)、油菜—早稻—晚稻(RP-R-R)、混播绿肥—早稻—晚稻(MS-R-R)处理高6.61%、3.29%及0.78%。其中产量构成中有效穗数、每穗粒数、结实率和千粒重也均以MV-R-R处理最高。水稻主要生育阶段的干物质积累,除抽穗期至成熟期MV-R-R低于RG-R-R处理外,在播种至分蘖盛期、分蘖盛期至孕穗期、孕穗期至抽穗期均是MV-R-R处理最高;与其他处理相比,增加幅度分别为11.38%—17.72%、4.50%—28.00%、1.85%—35.25%。水稻播种期至分蘖盛期和孕穗期至抽穗期两个生育阶段干物质积累量最大,是物质快速积累的阶段,各处理这2个生育阶段干物质积累量分别达到成熟期干物重的70.43%、60.50%、69.87%、69.08%;而抽穗期至成熟期各处理干物质积累所占比例均最低。干物质在茎鞘、叶片和穗分配情况,茎鞘的分配比例在孕穗期最大,并随着生育进程不断降低,在成熟期达到最低,各处理从58.30%—64.20%降低至27.95%—30.47%;叶片的分配比例也以孕穗期最大,并从该期的35.80%—41.70%降低至成熟期的13.07%—14.62%。另外,据调查,稻田杂草有7科11种,其中稗草(Echinochloa crusgalli)、鸭舌草(Monochoia vaginalis)、矮慈姑(Sagittaria pygmaea)和牛毛毡(Eleocharis yokoscensis)密度最大,群体数量为田间杂草的80.84%。MV-R-R处理对稻田杂草密度有显著影响,对杂草的抑制效果明显优于其他处理,RG-R-R处理的效果最差。通过分析杂草在群落中的相对优势度可以看出,MV-R-R和RG-R-R处理中杂草群落组成主要为稗草+鸭舌草+牛毛毡,而RP-R-R和MS-R-R处理为稗草+鸭舌草+矮慈姑。RG-R-R处理杂草物种丰富度最大,显著高于其他处理。从表征多样性的Shannon指数来看,RG-R-R冬种黑麦草处理的杂草物种多样性指数最高,而MV-R-R处理最低。从表征优势度的Simpson指数来看,MV-R-R处理的杂草优势度最高,RG-R-R处理最低。从Pielou均匀度指数来看,MV-R-R处理下的均匀度指数高于其他处理,但差异不显著,而其他冬季绿肥处理的稻田杂草均匀度有所下降,其中RG-R-R处理最低。【结论】紫云英—早稻—晚稻处理能保证较高的干物质积累量,具有较高的增产潜力,对杂草发生种类和密度有显著影响,并且有利于提高杂草均匀度,弱化稻田优势种杂草在田间的危害性。
    园艺
    黄瓜生长素反应因子(ARF)家族鉴定及表达特异性分析
    盛慧1, 2, 秦智伟1, 李文滨3, 周秀艳1, 武涛1, 辛明1
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1985-1994.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.012
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    【目的】鉴定黄瓜生长素反应因子(ARF),预测small RNAs并验证ARF与small RNAs和生长素的关系;分析ARF在种子萌发过程中的表达模式,推断ARF在黄瓜单性结实和种子萌发过程中是否起到关键作用。【方法】利用拟南芥和水稻ARF蛋白质序列检索黄瓜基因组数据库,对检索到的黄瓜ARF家族进行结构分析和small RNAs预测;将预测到的gma-MIR160o precursur构建到pCAMBIA2301植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其导入到单性结实黄瓜品种中,并对PCR检测为阳性的转基因植株进行RT-PCR验证;利用real-time RT-PCR方法分析ARF家族成员在生长素诱导后、开花时期及种子萌发阶段的表达模式。【结果】通过与拟南芥和水稻ARF蛋白序列的比对,共得到18个黄瓜ARF蛋白质序列。将其连同拟南芥和水稻的ARF蛋白质序列共分为4大类。从结构上看,外显子数目2-18不等,但同一类之间基因结构较为相似。进化树分析显示,18个基因之间的相似性不高;18个黄瓜ARF基因均有相对应的small RNA。其中, Csa010564、Csa011935、Csa015176、Csa020560和Csa022361可能都是miR160的靶基因。转基因试验进一步说明Csa010564、Csa011935和Csa015176在表达量上出现下降趋势,而Csa020560和Csa022361的表达量与对照相比略有上升,说明Csa010564、Csa011935和Csa015176是miR160的靶基因;在生长素诱导表达的试验中,Csa007296、Csa011935和Csa015176在根、茎和叶中的表达量均高于对照,说明ARF的表达受IAA的正调控;同时,以上3个基因在叶片和雌花花冠中的表达量均是开花第2 d低于开花当天,而在子房中的表达量确是第2天高于开花当天,尤其是Csa011935和Csa015176上调显著,说明ARF在子房发育过程中起到至关重要的作用;ARF在种子萌发过程中的表达分析显示:大部分基因在吸涨后12 h和48 h处于表达最高峰。【结论】ARF受生长素和相应的small RNAs调控。在黄瓜单性结实和种子萌发过程中,ARF可能起到了关键性作用。
    增氧栽培对桃幼树根系构型及氮素代谢的影响
    肖元松1, 彭福田1, 张亚飞1, 齐玉吉1, 王贵芳1, 王新亮2, 束怀瑞1
    中国农业科学. 2014, 47(10):  1995-2002.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.013
    摘要 ( 247 )   HTML ( 1 )   PDF (559KB) ( 463 )   收藏
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    【目的】探讨增氧栽培对桃幼树根系构型及根系氮素代谢的影响,为探明氧气在桃树根系生长发育中的作用奠定基础。【方法】在大田栽培条件下,以2年生桃品种‘春美’为试材,试验采用的增氧栽培装置为硬质塑料盒,底部有大小均匀的小孔。设置每3 d通气增氧1次,以不通气为对照,共2个处理。每隔20 d测定不同处理桃幼树生长期土壤氧气含量的变化,同时测定桃幼树根系活力、根系全氮含量以及根系转氨酶活性;新稍停止生长后,使用专业版WinRHIZO根系分析系统测定根系构型参数。分析增氧栽培对土壤氧气含量、桃幼树根系构型、根系活力以及根系氮素代谢的影响。【结果】增氧栽培显著提高了土壤氧气含量;增氧栽培桃幼树根系总长度、总表面积、一级侧根数、二级侧根数、根尖数、总体积、分枝数、交叉数较对照均有不同程度增加,分别比对照增加了50.53%、42.66%、13.64%、18.51%、44.94%、5.48%、37.01%和54.41%;一级侧根长度和根系平均直径减小;一级侧根与垂直向下方向的夹角整体上减小,小夹角数量增多,根系趋向于垂直分布;直径小于2 mm的根系干重显著高于对照的,直径大于5 mm的根系干重减少;增氧栽培的根系活力、根系硝酸还原酶(NR)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性分别比对照提高了19.04%、29.80%、6.56%和19.91%;根系全氮含量较对照提高了18.90%;另外,增氧栽培的桃幼树植株干物质积累量、干茎均高于对照。【结论】增氧栽培可较有效地提高土壤氧气含量,土壤氧气浓度的增加可促进桃幼树根系的发生与生长;提高桃幼树根系活力和氮素代谢水平,利于桃幼树植株干物质积累,促进桃幼树生长发育和形态建成。
    贮藏·保鲜·加工
    肌原纤维特性与鸡肉原料肉品质的关系
    王春青1, 李侠1, 张春晖1, 陈旭华1, 孙红梅1, 李银1, 李海1, 何雷堂2
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2003-2012.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.014
    摘要 ( 227 )   HTML ( 1 )   PDF (1016KB) ( 520 )   收藏
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    【目的】研究不同品种鸡胸肉肌原纤维特性与原料肉品质的关系,为筛选鸡肉加工专用品种、明确原料肉品质特性对鸡肉加工制品的影响提供理论依据。【方法】通过扫描电镜和透射电镜观察8个品种鸡胸肉的微观结构以及超微结构,利用Image-Pro Plus 6.0软件定量分析肌原纤维直径、密度以及肌节长度;同时结合原料肉蒸煮损失率、剪切力、质构特性以及肌原纤维小片化指数(MFI)等品质指标,借助相关分析,建立肌原纤维特性与原料肉品质之间的相关性。试验数据采用SAS9.2软件进行方差分析、多重比较分析和相关性分析。【结果】通过比较8个品种鸡胸肉的基本化学组成成分,发现不同品种鸡胸肉化学组成成分之间存在显著差异(P<0.05),其中,乌鸡的水分含量为75.44%,显著高于(P<0.05)其它品种,而柴母鸡的水分含量最低;蛋白质含量变幅较小,为22.03%—24.53%,三黄鸡的蛋白质含量最高,贵妃鸡的蛋白质含量最低;贵妃鸡的肌内脂肪含量为3.11%,显著高于(P<0.05)其它品种。通过对8个品种鸡胸肉的基本品质指标分析,结果表明,不同品种鸡胸肉的色泽、pH、嫩度、持水能力及质构特性存在显著差异(P<0.05);矮脚鸡的亮度值和红度值显著高于(P<0.05)其它几个品种;乌鸡胸肉的pH最高;贵妃鸡、清远鸡、乌鸡及童子鸡胸肉的剪切力较其它几个品种鸡小;乌鸡胸肉的蒸煮损失率最低。8个品种鸡胸肉的微观结构和超微结构观察结果显示,不同品种鸡胸肉的肌原纤维直径、密度、肌节长度及肌原纤维小片化指数之间也存在显著差异(P<0.05),其中贵妃鸡、清远鸡、乌鸡及童子鸡的肌原纤维直径较细,密度较大;清远鸡的肌节长度最长;三黄鸡和贵妃鸡的MFI值较其它品种的大,分别为138.67和134.67。相关分析结果表明,肌原纤维直径与剪切力呈显著正相关(P<0.05),肌原纤维密度与剪切力呈显著负相关(P<0.05);肌节长度与蒸煮损失存在显著负相关关系(P<0.05)。【结论】肌原纤维特性与原料肉的品质存在密切的关联性,肌原纤维特性会对原料肉品质以及加工特性产生重要影响。
    加热对鸡胸肉肌原纤维蛋白结构与凝胶特性的影响
    杨玉玲, 游远, 彭晓蓓, 陈银基
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2013-2020.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.015
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    【目的】研究加热温度对肌原纤维蛋白二级结构和凝胶特性的影响,并探讨肌原纤维蛋白二级结构与凝胶特性之间的内在关系。【方法】将活AA鸡20只(40日龄)屠宰,取鸡胸肉在-18℃下储存,用于提取鸡胸肉肌原纤维蛋白。用圆二色谱(CD)研究加热过程中肌原纤维蛋白二级结构(α-螺旋,β-折叠,β-转角和无规则卷曲)的变化;使用流变仪测定加热温度对肌原纤维蛋白的流变性质参数储能模量G’和相位角正切值 (Tanδ)的影响;将肌原纤维蛋白在不同温度下制备成凝胶,运用质构仪研究成胶温度对凝胶硬度和弹性的影响;用低场核磁共振仪(NMR)测定不同加热温度下成胶的肌原纤维蛋白凝胶的弛豫时间T2,以此研究不同温度下制得凝胶的水分布特性。利用SPSS17.0对所得的数据进行相关性分析等处理,以便阐明加热温度与肌原纤维蛋白二级结构及其凝胶特性的关系。【结果】加热温度显著影响肌原纤维蛋白的二级结构。随着加热温度升高,肌原纤维蛋白二级结构中α-螺旋含量逐渐降低。在30℃时α-螺旋含量为95.77%,加热温度在30—40℃以及70—80℃之间时α-螺旋含量变化很小,在40—70℃之间显著下降(P<0.05),到80℃时下降到45.05%。 β-折叠含量在30—45℃之间随温度上升缓慢增加,在40—70℃之间显著增加(P<0.05),超过70℃后含量仅略有增加;在30—80℃加热范围内,β-折叠含量从0.20%增加到12.65%。α-螺旋含量降低代表蛋白质分子展开程度增加,而β-折叠含量增加代表蛋白质分子间聚集程度增加。加热温度影响肌原纤维蛋白的流变性、质构特性和水分布特性。G’开始增加时的温度为42℃,表明肌原纤维蛋白在此温度下开始胶凝。在42—50℃之间,G’迅速增加到峰值177 Pa,之后G’迅速下降 (50—55℃),在55—75℃范围内G’再次快速增加;肌原纤维蛋白凝胶硬度在40—75℃内随温度上升而显著增大,在75℃时硬度达到最大值51.4 g。凝胶弹性在55℃达到弹性最大值0.754;在NMR图谱中T2有 3个峰,其中T22表示不可移动水,肌原纤维蛋白成胶温度在40—60℃内的凝胶T22值随加热温度上升从403.7 ms降到265.6 ms,即T22向快弛豫方向移动,表明随着温度的升高,水分子移动性降低。经相关性分析发现,加热温度、β-折叠含量与凝胶G’和凝胶硬度呈极显著正相关(P<0.01),相关系数均高于0.849,说明加热引起了蛋白质分子展开、聚集、并导致蛋白质分子胶凝、凝胶的G’及硬度显著变化。α-螺旋、β-折叠含量与凝胶的弹性和T22之间相关性不显著(P>0.05)。综合分析加热温度对α-螺旋含量、β-折叠含量和G’的影响,发现加热温度超过40℃时,加热同时导致肌原纤维分子展开、分子间聚集和胶凝;并发现展开后的肌原纤维蛋白分子部分重排成β-折叠结构是导致凝胶G’增加的关键因素;分析加热温度对β-折叠含量和凝胶硬度的影响,发现β-折叠结构含量增加也是导致凝胶硬度增加的关键因素。【结论】肌原纤维蛋白从30℃加热到80℃时,其α-螺旋含量显著下降,β-折叠含量显著提高,加热引起蛋白质二级结构发生重大变化,肌原纤维蛋白在42℃开始胶凝。凝胶硬度在75℃时达最大值51.4 g。加热温度、β-折叠含量与凝胶的G’和硬度呈极显著正相关,加热过程中β-折叠含量增加是导致凝胶G’和硬度增加的关键。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    一例真间性猪的研究
    周怡1, 2, 赵海全2, 刘玉清2, 于辉2, 帅素容1, 李华1, 2
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2021-2029.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.016
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    【目的】为探讨间性猪的生殖遗传发育基础和优化猪的种质资源,对一例间性猪进行了外部形态、细胞遗传、性激素、解剖以及组织病理学的研究。【方法】5月龄间性大白猪为试验组,以与试验组同窝的正常公母猪为对照组,分别进行内外生殖器官检察;PCR检测SRY基因;染色体组型和带型分析,取外周血进行常规短期淋巴细胞培养,获取中期细胞分裂相,制成染色体标本,G显带和C显带处理;放射免疫法测定静脉血睾酮(testosterone, T)、雌二醇(estradiol, E2)、促黄体素(luteinizing hormone, LH)、促卵泡素(follicle- stimulating hormone, FSH)、孕酮(progesterone, PRG)和催乳素(prolactin, PRL)含量;生殖腺病理切片制做及观察,取2 cm×2 cm大小生殖腺组织,10%甲醛固定后进行常规石蜡切片制作,苏木(Hematoxylin)与伊红(Eosin)染色(H.E.染色),镜检并显微照相;下丘脑和垂体电镜切片制做及观察,取2 mm×2 mm大小脑部组织,2.5%戊二醛固定后进行常规电镜切片制作,透射电镜观察并拍摄。【结果】结果表明,间性猪外生殖器为雌性表型,外阴位于肛门下方,阴蒂肿大突出于阴门之外,左侧可见睾丸,右侧隐睾,阴囊发育良好。间性猪和正常母猪染色体组型为38, XX,SRY阴性,核型组成为10sm+4st+12m+12t,G带带型没有差异,C带的显带基本相似,1、3、4、6、8、9、10、13、14和16号染色体均不同程度显带,以圆形带为主。试验组和对照组各号染色体的相对长度及臂比值差异均不显著(P>0.05)。睾酮和雌二醇水平均介于正常公、母猪之间,促黄体素、促卵泡素、孕酮和催乳素水平均高于正常母猪,LH/FSH比值明显低于正常母猪。剖检发现间性猪有雌雄两性生殖腺,有两个卵睾体,左侧有附睾,子宫体、子宫角和阴道明显退化,阴蒂中隐藏有假阴茎。病理组织镜检发现卵睾体为睾丸和卵巢混合组织,柱状上皮细胞退化,有正常莱氏细胞,无精原细胞或其残留物存在;附睾假复层纤毛柱状上皮细胞正常,内腔无精细胞或其残留物;子宫内膜有较低程度退化,部分内膜腺正常。试验组下丘脑和垂体分泌细胞较对照组发达,促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神经元核大且饱满,细胞器增多并融合;垂体以促性腺激素细胞为主,细胞数量明显增多,分泌颗粒大小不均;催乳素细胞数量较正常母猪多,分泌颗粒电子密度也较大。【结论】该间性猪为真间性,无染色体易位现象,性激素紊乱,无种用价值。
    共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化
    徐龙龙, 吴杰, 郭军, 李继莲
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2030-2037.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.017
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    【目的】了解人工饲养的兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)肠道内共生菌群的组成,探明主要肠道共生菌群在熊蜂生长发育过程中的变化规律,为进一步开展熊蜂共生菌功能的研究奠定基础。【方法】以兰州熊蜂肠道总DNA为模板,使用细菌通用的774F和1391R引物进行PCR扩增,构建细菌16S rDNA文库,挑取单克隆菌落测序,测得序列去除chimera后,以序列相似性97%为标准,划分分类操作单元(operational taxonomic units,OTU),采用BLASTn进行序列同源性分析,确定细菌种类,分析熊蜂肠道菌群的组成。根据克隆文库测得的Gilliamella apicola和Snodgrassella alvi细菌16S rDNA序列设计特异性引物。用G. apicola和S. alvi的特异性引物进行PCR扩增,构建重组子质粒,构建好的质粒经浓度测定后,10倍梯度稀释成5个浓度梯度,进行荧光定量PCR检测,绘制标准曲线。以兰州熊蜂的卵、幼虫、蛹以及0、5、10、15、20日龄的工蜂肠道DNA为模板,采用熊蜂β-actin为内参基因,对样品中的共生菌G. apicola和S. alvi进行荧光定量PCR分析,并比较不同日龄、不同虫态每微升肠道基因组DNA样品中检测到的细菌16S rDNA基因的拷贝数,分析共生菌数量在熊蜂生长发育过程中的变化。不同日龄、不同虫态之间相对表达量的显著性差异用软件SPSS19.0的单因素ANOVA方差分析进行统计。【结果】从文库中随机挑选213个单克隆进行测序,经过Chimeras分析后,共得到202个有效序列,这些序列共划分为16个OTU。测得的序列与登录的相应细菌16S rDNA序列的相似性在93%—99%。在克隆文库测得的细菌16S rDNA序列中,G. apicola占45%、S. alvi占30%、Bifidobacterium占10%、Fructobacillus fructose占5%、Lactobacillus占2%、Flavobacterium aciduliphilum占2%,其他细菌占6%。其中G. apicola和S. alvi为兰州熊蜂肠道内的主要共生菌,qPCR结果表明两种共生菌在不同日龄、不同虫态的熊蜂肠道内都能检测到,两种细菌的数量在熊蜂发育过程中的变化趋势相似,即先增加后减少,最后达到稳定状态。G. apicola和S. alvi在熊蜂的卵、幼虫和蛹中数量都较少,在5日龄时的数量达到峰值,显著高于其他日龄,之后又逐渐减少,在15日龄后趋于稳定,第15、20日龄之间差异不显著。【结论】人工饲养的兰州熊蜂肠道中主要有4个种属的常见共生菌:G. apicola、S. alvi、F. fructosus和Bifidobacterium,其中G. apicola和S. alvi是其体内的优势菌。G. apicola和S. alvi在熊蜂中都具有水平和垂直传播的特性,两种共生菌在熊蜂的卵、幼虫和蛹中都检测到,但数量较少,工蜂出房后细菌大量增殖并在出房15 d左右形成稳定的共生菌群。熊蜂生长发育过程中体内共生菌数量的变化可能与这两种细菌对熊蜂的作用有关。
    研究简报
    裸燕麦萌发期耐盐性综合评价与耐盐种质筛选
    陈新1, 张宗文1, 2, 吴斌2
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2038-2046.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.018
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    【目的】对来自不同生态区的278份裸燕麦种质在萌发期的耐盐性进行综合评价,以期为裸燕麦萌发期耐盐性的鉴定和评价提供方法指导,同时为裸燕麦耐盐育种的亲本选择提供丰富的耐盐材料。【方法】以1.2%NaCl水溶液进行盐胁迫,以蒸馏水培养为对照,利用培养皿纸上发芽法在人工气候培养箱中进行裸燕麦种质萌发期的耐盐性鉴定,培养条件为25℃恒温、相对湿度(70±5)%、每天12 h光照(6:00—18:00)、光照强度150 μmol?m-2?s-1。以胚根至少与种子等长、苗高不短于种子长的1/2为发芽标准,培养96 h时统计各供试种质的发芽势,培养168 h时统计各供试种质的最终发芽率并测量幼苗的最长初生根长和苗高,以发芽势、发芽率、根长、苗高4个性状来鉴定供试种质对盐胁迫的反应。以基于4个鉴定指标的耐盐系数为评价依据,根据各指标耐盐系数的隶属函数值的变异系数来分配各指标的权重,利用加权隶属函数法对供试278份裸燕麦种质进行综合评价,结合聚类分析对供试种质进行耐盐性级别划分。【结果】与正常条件相比,在1.2% NaCl胁迫下,除了SHX88和NM47以外,其他所有材料的发芽势和发芽率都降低;所有材料的根长和苗高都受到抑制。不同材料在4个鉴定指标上都表现出差异。根据加权隶属函数值和聚类分析,可将供试278份裸燕麦种质分为耐盐性不同的5个级别:17份材料高度耐盐(1级)、114份材料耐盐(2级)、106份材料中等耐盐(3级)、25份材料对盐胁迫敏感(4级)、16份材料对盐胁迫高度敏感(5级)。在4项鉴定指标中,发芽势和发芽率与萌发期耐盐性的关系最为密切,但发芽率在材料间的表现比发芽势更为稳定。【结论】发芽率可作为裸燕麦萌发期耐盐性快速鉴定或种质资源初步筛选的鉴定指标。加权隶属函数法对于裸燕麦种质耐盐性综合评价具有较好的应用价值。SHX75等17份高耐盐性裸燕麦材料可进一步用于耐盐机理研究、耐盐育种以及盐碱地栽培。
    水氮管理模式对杂交籼稻冈优527群体质量和产量的影响
    孙永健1, 马均1, 孙园园2, 徐徽1, 严奉君1, 代邹1, 蒋明金1, 李玥1
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2047-2061.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.019
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    【目的】研究水氮管理模式对杂交籼稻群体质量及产量的影响,为水稻水肥高效利用提供依据。【方法】以杂交籼稻冈优527为材料,通过淹灌(W1)、控制性交替灌溉(W2)和旱种(W3)3种灌水处理及4种氮肥运筹处理(基肥﹕分蘖肥﹕穗肥分别为7﹕3﹕0、5﹕3﹕2(穗肥于倒4叶龄期施入)、3﹕3﹕4(穗肥于倒4、2叶龄期分2次等量施入)、2﹕2﹕6(穗肥于倒4、2叶龄期分2次等量施入),分别记为N1、N2、N3、N4),并设置不施氮处理,记为N0,分析水氮管理模式对杂交籼稻群体质量和产量形成的影响,并探讨水氮互作下群体质量指标与产量间的关系。【结果】水与氮对水稻主要生育时期干物质累积、叶面积指数(LAI)、抽穗期粒叶比、剑叶净光合速率、群体透光率及产量均存在显著的互作效应。互作效应分解分析表明,适当的氮肥后移处理、W2处理对产量均表现为正效应,且氮肥运筹效应大小表现为:N3>N2>N1,氮肥后移比例过大至N4处理水平、W3处理均会加重灌水处理的负效应;而水氮的交互作用结果表明,W2处理相对于其他灌水处理能促进氮肥肥效,达到以水促肥的目的,且W2模式下氮肥后移量可占总施氮量的40%,与基肥﹕分蘖肥﹕穗肥(倒4、2叶龄期分2次等量施入)为3﹕3﹕4氮肥运筹模式(N3处理)相配套,其水氮交互正效应不同程度的高于其他处理,能及时对群体分蘖数进行调控,提高成穗率,保证抽穗期水稻适宜的LAI及粒叶比,适当降低了上3叶叶倾角,提高了高效叶面积率及保持了群体透光率,有利于提高结实期群体光合产物的积累,并在保证一定数量有效穗及结实率的前提下,显著提高穗粒数及千粒重,最终促进了产量的增加,为本试验条件下最佳的水氮耦合运筹方式。而其他各水氮处理出现交互优势减弱,甚至出现负效应,均不利于产量的提高;尤其W3处理和氮肥运筹的互作效应对产量的影响均为负值,且氮肥后移比例过重会导致负效应加重;本试验旱作模式下,结合产量表现,应减少氮肥的后移量,氮肥后移量可占总施氮量的20%—40%为宜,以缓解水氮互作下的负效应,而淹灌模式下,氮肥后移量可占总施氮量的40%—60%为宜。相关分析表明,水氮互作下各群体质量指标与产量间显著或极显著正相关(r=0.589*—0.978**),尤其以抽穗后群体干物质增加量、齐穗至齐穗后20 d群体透光率的减少量与产量相关性较高。【结论】本试验条件下,W2N3为最优的水氮调控模式,在一定程度上调节并优化水稻群体质量指标体系,提高稻谷产量,W1模式与N3氮肥运筹为宜,而W3模式下可适当减少氮肥的后移量以基肥﹕分蘖肥﹕穗肥(倒4叶龄期一次性施入)为5﹕3﹕2的氮肥运筹模式(N2处理)为宜。
    一个甘蓝型油菜胚珠败育突变体的形态鉴定及生理特性分析
    许汪洁, 傅鹰, 董红利, 陈致富, 张沁芸, 毛少帅, 贺亚军, 钱伟
    中国农业科学. 2014, 47(10):  2062-2068.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.020
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    【目的】油菜胚胎的发育与油菜产量的构成因子、粒重和每荚果粒数密切相关。通过对油菜胚珠发育障碍突变体的形态鉴定和生理特性分析,揭示油菜胚胎的发育机制。【方法】对一个胚珠发育障碍的突变株OVA047的胚珠发育进行了组织解剖学观察,并对可能影响败育的硼营养以及发育中的温度变化等因素进行了分析。采用醋酸洋红染色法鉴定OVA047的花粉育性,选取OVA047植株上即将开放的花蕾,人工去雄授粉后,每隔4 h剥取子房,观察花粉管伸长情况。对正常材料和突变体OVA047一个月龄的幼苗进行叶面施硼处理,调查营养生长情况,花粉育性和结实率。对OVA047人工剥蕾去雄并授粉,标记授粉时间,分别在授粉后不同时期观察统计败育率,记载日均温度和每日最高温度,调查温度与败育率的相关性,用SAS进行统计分析。【结果】突变体OVA047的雄蕊和雌蕊发育正常,花粉可染率95.90%。花粉管萌发正常并能到达胚珠,授粉后7 d和14 d胚珠解剖观察均发现其发育良好,授粉20 d后胚胎出现败育,尤其主花序顶部败育严重,授粉35 d后该部位平均每果有效胚珠数为0.8,为对照的4%。在相同硼肥量的处理中,正常材料与OVA047叶片硼含量均随着施硼量的增加而增加,OVA047叶片的硼含量与正常材料无显著差异;在不同施硼处理间,OVA047的败育程度无显著变化,施硼处理后OVA047依旧败育,平均每果有效胚珠数仅为3.2,平均败育率为60%左右,而对照材料不论施硼处理与否均结实正常,平均每果有效胚珠数为29。2年观察结果均显示突变体OVA047在重庆种植时,主花序顶部、中部、基部胚珠的大规模败育现象均发生在温度显著上升时期,胚珠发育后期随温度升高而败育加剧,不同组织部位的胚珠败育率与日最高气温相关联。【结论】突变体OVA047的败育并非源于受精障碍,与硼营养障碍无关,但可能受环境温度的影响。