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当期目录

    2014年 第47卷 第4期 刊出日期:2014-02-15
      
    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    磷转运蛋白基因TaPHT2;1在染色体上定位 及对小麦磷素吸收和利用效率的影响
    郭丽1, 郭程瑾1, 路文静2, 李小娟2, 肖凯1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  613-621.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.001
    摘要 ( 255 )   HTML ( 1 )   PDF (528KB) ( 492 )   收藏
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    【目的】以中国春遗传背景的整套B染色体双端体为材料,鉴定磷转运蛋白基因TaPHT2;1的染色体定位特征。解析不同供磷水平下,上述材料和不同磷利用效率小麦品种该基因的表达特征及其与植株干物质生产能力和磷效率特征的联系。【方法】采用溶液培养法水培中国春(CS)及该品种遗传背景的整套B染色体组双端体和不同磷效率小麦品种材料。以B染色体组供试端体为材料进行TaPHT2;1 PCR扩增,鉴定TaPHT2;1在染色体上的定位。采用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术分析B染色体组供试端体和小麦品种TaPHT2;1的表达水平。采用常规分析技术,测定供试材料单株干重和磷吸收参数。【结果】①PCR检测发现,在CS及所有供试B染色体组双端体材料中,除缺失1B长臂的1BS外,其它所有材料均能特异扩增出目标基因TaPHT2;1,表明TaPHT2;1定位在1B长臂。②丰、缺磷条件下,TaPHT2;1在CS及除1BS外双端体根、叶中的表达均表现为叶片优势表达特征,且在叶片中表达受到低磷胁迫的诱导。TaPHT2;1在根系中的表达不受低磷逆境调控。表明TaPHT2;1在介导丰磷下磷素吸收、转运及增强低磷下植株体内磷素再度调运中可能发挥重要功能。③丰磷条件下,与CS相比,1BS的单株干重和全磷含量显著降低;缺磷条件下,1BS的单株干重与CS相比也显著下降,但全磷含量增加。表明位于1B染色体长臂后的磷转运蛋白基因TaPHT2;1,对丰、缺磷条件下的植株磷素吸收、转运具有较大影响,进一步对不同供磷水平下的植株干重产生重要调控效应。④丰磷条件下,与CS相比,1BS的单株磷累积量显著增加,磷利用效率没有改变;缺磷条件下,与CS相比,1BS的单株磷累积量没有变化,磷利用效率显著降低。不同磷利用效率品种相比,丰磷条件下,随着品种磷利用效率提高,叶片中TaPHT2;1的表达水平、单株干重、全磷含量和单株磷累积量也随着增加;缺磷条件下,随着小麦品种磷利用效率提高,叶片中TaPHT2;1的表达水平、单株干重和磷利用效率也随之增高,但全磷含量呈下降趋势,单株磷累积量品种间差异较小。因此,TaPHT2;1的表达水平与小麦品种丰、缺磷条件下的磷素吸收、利用和干物质积累能力具有紧密联系。【结论】小麦磷转运蛋白基因TaPHT2;1位于1B染色体长臂。该基因通过其特定对外界供磷水平产生应答,在较大程度上调控植株的磷素吸收和利用能力,对不同供磷水平下的植株干重产生重要影响。TaPHT2;1在调控植株丰磷下磷素吸收和低磷下磷素利用中发挥重要作用,可作为鉴定小麦品种磷效率的评价指标。
    紫花苜蓿盐诱导HD-Zip类转录因子MsHB2的克隆及功能分析
    李明娜1, 2, 龙瑞才1, 杨青川1, 2, 沈益新2, 康俊梅1, 张铁军1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  622-632.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.002
    摘要 ( 284 )   HTML ( 1 )   PDF (1081KB) ( 678 )   收藏
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    【目的】在已有的一条紫花苜蓿(Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1)盐诱导未知基因的EST序列基础上,克隆其(MsHB2)全长序列并分析其功能,以进一步了解其在紫花苜蓿中的耐盐调控机理。【方法】以先前获得的EST序列为基础设计引物,使用RACE法从紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,经DNAMAN软件拼接后得到其全长序列。使用多种生物信息学软件对MsHB2的开放阅读框,编码蛋白等电点、分子量、疏水性、亚细胞定位、进化关系等进行预测分析。构建MsHB2的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsHB2与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。将生长30 d的中苜一号分别进行300 mmol?L-1 NaCl和0.1 mmol?L-1 ABA胁迫处理,取胁迫处理0、2、4、10、24 h后的根和茎叶组织提取总RNA并进行荧光定量PCR分析。构建了MsHB2的植物超表达载体,转化农杆菌GV3101菌株,使用农杆菌花序侵染法转化拟南芥并在盐胁迫条件下对转基因株系进行相关表型分析。【结果】将RACE法克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列拼接后得到1 126 bp的全长序列,序列分析表明,其编码蛋白包含247个氨基酸,具有一个同源异型结构域和一个亮氨酸拉链结构域,与拟南芥HD-Zip第I类转录因子ATHB12具有较高相似性。进化树聚类分析表明MsHB2属于第Ⅰ类同源异型域亮氨酸拉链蛋白。洋葱亚细胞定位分析表明MsHB2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsHB2受300 mmol?L-1 NaCl和0.1 mmol?L-1 ABA胁迫诱导而表达量显著升高。转基因研究表明在NaCl和ABA胁迫下,过量表达MsHB2的转基因拟南芥表现比野生型拟南芥更敏感。【结论】从紫花苜蓿中克隆得到一个定位于细胞核的同源异型域亮氨酸拉链蛋白基因MsHB2,其在紫花苜蓿中受NaCl和ABA胁迫诱导,并在NaCl和ABA胁迫条件下抑制转基因拟南芥的生长。推测MsHB2可能通过ABA信号途径参与紫花苜蓿盐胁迫应激调控,并在盐胁迫等非生物胁迫下对紫花苜蓿的抗逆性起负调控作用。
    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    补充灌溉和施氮对玉米籽粒淀粉粒粒度分布的影响
    石德杨1, 2, 张海艳1, 3, 董树亭2, 3
    中国农业科学. 2014, 47(4):  633-643.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.003
    摘要 ( 266 )   HTML ( 1 )   PDF (636KB) ( 541 )   收藏
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    【目的】淀粉粒粒度分布是评价淀粉品质的一个重要因素,环境因素对淀粉粒粒度分布的影响较大,水分和氮肥是玉米高产优质栽培中的主要农艺措施。因此,明确补充灌溉和施氮对玉米籽粒淀粉粒粒度分布特征的影响及其与淀粉糊化特性、粒重和淀粉组分之间的关系,能为玉米淀粉品质调控提供理论依据,也有利于玉米淀粉的定向加工利用。【方法】以郑单958为供试材料,设置雨养(W1)与补充灌溉(W2)两个水分处理,其中补充灌溉处理以土壤含水量是否低于田间持水量的60%来确定是否灌水,以灌水后土壤含水量达到田间持水量的80%来确定灌水量,其计算公式为m=10ρbH(?i-?j),式中m为补灌量(mm),H为该时段补充灌溉深度(cm),ρb为补充灌溉深度土壤容重(g•cm-3),βi为目标含水量(田间持水量×目标相对含水量),βj为自然含水量;按每生产100 kg籽粒耗氮3 kg,在67 500 株/hm2种植密度下产量达10 500 kg•hm-2的标准设计最高氮肥处理,即设0(N1)、160(N2)、320(N3)kg•hm-2 3个氮肥处理。采用激光衍射粒度分析仪测定成熟期玉米籽粒淀粉粒体积、数目和表面积分布特性,借助RVA仪测定淀粉糊化特性,采用双波长法测定淀粉组分含量,并对淀粉粒体积分布与糊化特性、粒重、产量及淀粉组分做相关性分析。【结果】玉米籽粒淀粉粒粒径分布范围为0.38—39.78 μm,其上限介于30.07—39.78 μm。淀粉粒的体积和表面积表现为三峰分布,参照小麦研究中以双峰曲线凹处为分界线的分类方法,以3.5 μm和7.4 μm为界线,将玉米淀粉粒分为小型(<3.5 μm)、中型(3.5—7.4 μm)和大型(>7.4 μm)三类。淀粉粒的数目表现为单峰分布,其中小型淀粉粒数目占总数的98%以上。增施氮肥及补充灌溉降低小型淀粉粒体积、表面积和数目的百分比,提高大型淀粉粒体积的百分比。施氮和补充灌溉增加玉米淀粉峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回复值及籽粒产量、粒重、总淀粉和支链淀粉含量,降低峰值时间、糊化温度及直链淀粉含量和直/支比。直链淀粉含量、直/支比、峰值时间和糊化温度与小型淀粉粒的体积百分比呈极显著正相关,与大型淀粉粒的体积百分比呈极显著负相关;产量、粒重、支链淀粉和总淀粉含量、峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回复值与小型淀粉粒的体积百分比呈极显著负相关,与大型淀粉粒的体积百分比呈(极)显著正相关。【结论】水分和氮肥处理显著影响淀粉粒的粒度分布和糊化特性,补充灌溉和施氮320 kg•hm-2时小型淀粉粒体积比最低,大型淀粉粒体积比最高,淀粉糊化特性最优。
    不同抗旱性花生品种的叶片形态及生理特性
    厉广辉;张昆;刘风珍;刘丹丹;万勇善
    中国农业科学. 2014, 47(4):  644-654.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.004
    摘要 ( 314 )   HTML ( 1 )   PDF (616KB) ( 757 )   收藏
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    【目的】筛选叶片抗旱相关性状,探索性状指标大小的评价方法,揭示不同抗旱性花生品种抗旱的叶片形态及生理机制。【方法】以12个花生品种为试验材料,在人工控水条件下,于苗期及结荚期给予干旱胁迫及正常灌水对照2个土壤水分处理,苗期处理以盆栽种植方式进行,称重法控水,结荚期处理在池栽条件下进行,测墒补灌法控水,控水期间以电动防雨棚遮雨。测定苗期干旱及正常供水对照的叶片组织结构、厚度、比叶重、叶面积、光合速率、叶绿素含量等叶片性状指标,对比分析上述叶片性状与花生品种抗旱性的关系,以性状指标大小评价不同花生品种抗旱的叶片机制,以生物量抗旱系数评价苗期抗旱性,以收获期产量抗旱系数评价结荚期抗旱性。【结果】通过2年的试验发现,干旱胁迫下,不同花生品种生物量抗旱系数及产量抗旱系数有显著差异,苗期与结荚期抗旱性基本一致。根据产量抗旱系数可将12个花生品种抗旱性分为强、中、弱3级,抗旱性强的品种为A596、山花11号、如皋西洋生,花育20号、农大818、海花1号、山花9号和79266为中度抗旱品种,抗旱性弱的品种有ICG6848、白沙1016、花17和蓬莱一窝猴。干旱胁迫改变了叶片组织结构,降低了单株叶面积、功能叶面积、气孔导度、光合速率和蒸腾速率,增加了比叶重。不同抗旱性花生品种叶片性状有显著差异,抗旱性强的品种在对照及干旱胁迫下均具有较高的叶片厚度、栅/海比、比叶重、单株叶面积、光合速率。干旱胁迫下,较大的叶片栅/海比值、比叶重和光合速率是如皋西洋生和山花11号抗旱的叶片机制;山花9号与花育20号较大的单株光合面积,A596较大的光合速率是它们重要的抗旱机制。相关分析表明,干旱胁迫下的叶片栅/海比、比叶重、单株叶面积和光合速率与品种抗旱系数的相关性达极显著水平。【结论】山花11号和79266分别可作为花生强、弱抗旱性鉴定的标准品种。花生出苗后10 d进行40%土壤相对含水量的干旱处理,持续胁迫14 d时的叶片栅/海比、单株叶面积、比叶重和光合速率可鉴定花生种质的叶片抗旱能力。正常灌水条件下,始花期的栅/海比、单株叶面积、比叶重也能反映花生叶片的抗旱级别。山花11号可作为花生叶片优异抗旱性状鉴定的标准品种。
    干旱胁迫对持绿性高粱光合特性和内源激素 ABA、CTK含量的影响
    周宇飞, 王德权, 陆樟镳, 王娜, 王艺陶, 李丰先, 许文娟, 黄瑞冬
    中国农业科学. 2014, 47(4):  655-663.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.005
    摘要 ( 270 )   HTML ( 1 )   PDF (498KB) ( 665 )   收藏
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    【目的】研究干旱胁迫对不同持绿性高粱光合特性以及叶片和根系中内源激素含量的影响,为高粱持绿性资源的发掘和应用提供理论依据。【方法】采用盆栽试验的方法,选用持绿性高粱B35和非持绿性高粱三尺三为试验材料,设置无干旱胁迫(土壤含水量为田间最大持水量的75%—80%)和干旱胁迫两种水分处理(土壤含水量为田间最大持水量的45%—50%),分别在开花期和灌浆期进行干旱胁迫,研究干旱胁迫下不同持绿性高粱光合作用、叶绿素荧光特性以及叶片和根系中内源激素(脱落酸和细胞分裂素)含量的变化,并分析干旱胁迫下叶片和根系中内源激素含量的动态平衡以及叶片中内源激素含量与光合特性参数间的相关性。【结果】开花期和灌浆期干旱胁迫均抑制了不同持绿性高粱的光合作用,但干旱胁迫下B35的叶绿素含量(Chl)、光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、光系统Ⅱ(PSⅡ)的初始叶绿素荧光(Fo)、最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学淬灭系数(qL)以及电子传递速率(ETR)的降低幅度均明显小于三尺三;且在灌浆期三尺三Chl的衰减程度更为明显,Pn的下降程度也更大。同时,干旱胁迫使三尺三在灌浆期PSⅡ反应中心结构受到了损害或失活。开花期和灌浆期干旱胁迫提高了不同持绿性高粱根系和叶片中脱落酸(ABA)的含量,B35叶片和根系中ABA含量的增幅显著高于三尺三,且在灌浆期的增幅更大;干旱胁迫降低了不同持绿性高粱根系和叶片中细胞分裂素(CTK)的含量,三尺三根系和叶片中CTK含量的降低程度明显高于B35,且在灌浆期减幅更大。B35和三尺三叶片中ABA的含量高于根系,CTK的含量低于根系;干旱胁迫降低了叶片和根系中CTK/ABA的比值,并且在开花期和灌浆期B35的降低程度均大于三尺三。ABA含量与Pn呈显著负相关,与ETR呈极显著负相关;除Fo外,CTK含量与Gs呈显著正相关,与Chl、Pn、Fv/Fm、qL和ETR呈极显著正相关。【结论】干旱胁迫下,持绿性高粱比非持绿性高粱具有较高的叶绿素含量和光合能力。ABA和CTK共同作用调控气孔的运动,并影响光合速率及光合电子传递等其它光合生理过程。
    基于计算机视觉的水稻叶部病害识别研究
    刘涛1, 仲晓春2, 孙成明1, 郭文善1, 陈瑛瑛1, 孙娟1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  664-674.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.006
    摘要 ( 331 )   HTML ( 1 )   PDF (858KB) ( 937 )   收藏
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    【目的】文章重点分析了病健交界特征参数、病害识别流程对提高病害识别准确率的影响。实现水稻叶部15种主要病害的准确识别,尤其是相似病害的判断。【方法】(1)病斑图像获取:水稻叶部病害图像来源包括水稻大田、病害图册和病害数据库,文中选用改进的mean shift图像分割算法提取病叶图像中的病斑并根据相关方程获取病斑特征信息。(2)特征参数的选择与设计:首先选取一至三阶颜色矩和颜色直方图作为病害的颜色特征参数,选取球状性、偏心率和不变矩作为病斑的形状特征参数,选取角二阶矩、对比度和相关作为病斑的纹理特征参数;然后针对相似病斑误报率高的问题提出一种病健交界特征参数,通过病斑内部、边缘和外围颜色上的差异描述该特征,并根据3个区域相互间归一化颜色直方图的欧氏距离计算该项特征参数,该参数可以用于描述病斑与健康部分交界处的特征。(3)病害识别流程的设计:根据病害在颜色、形状、纹理、病健交界4个特征上差异的显著程度设计完成病害识别流程,流程中首先通过颜色特征识别病害,对于通过颜色特征无法识别的病害再通过形态特征识别,倘若形态特征依然无法识别则通过纹理和病健交界特征进行最终识别。(4)病害识别模型的建立:将病害数据分成两部分,一部分用于建立模型,另一部分用于模型的验证;利用LibSVM程序包完成建模,其中svmtrain函数用于建立支持向量机模型,Grid程序用于优化参数,svmpredict函数用于对模型进行验证。【结果】15种水稻叶部病斑可以从复杂的背景中分割出来,并可快速准确的被识别,平均识别准确率为92.67%,平均漏报率为7.00%,最大漏报率和误报率分别为15.00%和25.00%;病健交界特征参数引入后,识别准确率提高了14.00%,平均漏报率降低了7.50%,漏报率最大降幅为20.00%,误报率最大降幅为65.00%;与用所有特征参数直接进行病害识别相比,采用本文提出的识别流程进行病害识别的准确率提高了12.67%,漏报率降低了9.33%,一些病害的漏报率和误报率降幅达30.00%以上;在识别流程各步骤中,颜色特征识别环节的平均准确率为96.71%,漏报率和误报率均未超过10.00%;形态特征识别环节的平均准确率为94.17%,漏报率和误报率均未超过15.00%;纹理和病健交界特征识别环节的平均准确率为91.50%,漏报率和误报率均未超过25.00%。【结论】利用mean shift图像分割算法可以准确分割水稻叶部病斑;基于支持向量机模型的分类方法可以对15种水稻病斑准确分类;论文中提出的病健交界特征参数以及病斑识别流程均提高了病斑的识别准确率;病健交界特征参数对提高一些相似病害的识别精度效果显著;将这些方法相结合可以有效对水稻常见叶部病害进行识别,为水稻病害的田间智能诊断提供技术支撑。
    植物保护
    水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析
    陈雪凤, 魏楚丹, 张庆, 刘琼光
    中国农业科学. 2014, 47(4):  675-684.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.007
    摘要 ( 279 )   HTML ( 1 )   PDF (727KB) ( 543 )   收藏
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    【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌(Dickeya zeae)双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。
    噬菌体展示纳米抗体模拟黄曲霉毒素抗原的活性表征
    王妍入1, 2, 4, 李培武1, 2, 3, 4, 5, 张奇1, 3, 4, 丁小霞1, 4, 5, 张文1, 2, 5
    中国农业科学. 2014, 47(4):  685-692.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.008
    摘要 ( 323 )   HTML ( 1 )   PDF (644KB) ( 702 )   收藏
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    :【目的】笔者实验室前期免疫并构建噬菌体展示纳米抗体库,应用此抗体库筛选、制备可以用作黄曲霉毒素无毒替代抗原的纳米抗体。本研究旨在探明已筛选出的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5用作黄曲霉毒素替代抗原的活性,为后续纳米抗体的合成以及黄曲霉毒素绿色免疫分析方法的建立奠定基础。【方法】前期,笔者实验室对羊驼免疫黄曲霉毒素抗原(AFB1-BSA),经过5次免疫后,取血,提取RNA,反转录为cDNA,并采用PCR技术对抗体可变区VHH区域进行扩增,与载体pComb3X偶联,构建噬菌体展示纳米抗体库;经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与黄曲霉毒素竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5。本研究通过将抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11固定在酶标板上,以噬菌体展示纳米抗体Phage2-5作为竞争抗原,与反应体系中的游离黄曲霉毒素竞争结合抗体,构建酶联免疫分析(ELISA)体系,检测游离黄曲霉毒素含量,并分别对该方法的灵敏度、交叉反应率、缓冲液和样品基质对反应体系的影响进行测定。【结果】采用棋盘法确定了抗体最佳包被浓度为1.25 mg·mL-1,噬菌体最佳使用浓度为5´1011 pfu/mL。在最优条件下建立基于噬菌体展示纳米抗体Phage2-5的ELISA法,对黄曲霉毒素B1的IC50值为0.054 ng·mL-1,对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为38.6%、70.1%、14.5%、14.6%;反应最高耐受甲醇浓度为20%;当pH值为7.0时,反应灵敏度最高,升高或降低pH对反应灵敏度均有影响;盐离子浓度对反应灵敏度影响不大,反应体系在5´PBS的环境下仍能保持较高活性,但纯水溶液不利于反应的进行;因此,该反应的最佳反应缓冲液是pH值为7.0的0.01 mol·L-1 磷酸盐缓冲液(PBS),花生、大米、玉米基质对反应体系无显著影响。【结论】噬菌体展示纳米抗体Phage2-5具备良好的模拟黄曲霉毒素抗原的生物活性,用作替代抗原建立的免疫分析方法灵敏度高、甲醇耐受能力强,并且样品基质效应不明显,具有进一步研制黄曲霉毒素模拟抗原的前景。
    高温胁迫对柑橘全爪螨存活及生殖的影响
    杨丽红1, 2, 黄海2, 王进军2
    中国农业科学. 2014, 47(4):  693-701.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.009
    摘要 ( 256 )   HTML ( 1 )   PDF (525KB) ( 460 )   收藏
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    【目的】研究高温胁迫对柑橘全爪螨(Panonychus citri)存活及生殖的影响,揭示该螨在高温条件下的种群动态规律。【方法】柑橘全爪螨采自中国农业科学院柑橘研究所,在人工气候室饲养10代后用于试验,饲养条件为温度(25±1)℃,相对湿度75%—80%,光周期14 h﹕10 h(L﹕D),寄主植物为盆栽柑橘苗。挑取雌成螨于离体柑橘叶片上,让其产卵12 h,然后移除雌成螨,收集的卵继续饲养至后若螨时,采用叶蝶法单头饲养到成螨。将雌成螨单头分别置于32、35、38及41℃恒温培养箱中热激一定时间,然后再放回上述人工气候室条件下,每个叶碟上再放1头雄成螨,每个处理至少设30个重复,以25℃为对照。每24 h观察、计数产卵情况,直至雌成螨死亡,测定高温及作用时间对柑橘全爪螨雌成螨寿命及生殖的影响。利用SPSS 10.0对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),平均数的多重比较采用Duncan multiple range test(DMRT,P<0.05)。【结果】高温35及41℃分别胁迫柑橘全爪螨雌成螨1 h,其寿命显著缩短至10.1及8.2 d(P<0.001)。且随胁迫时间延长,影响加剧。38℃胁迫雌成螨3 h,其寿命显著缩短至9.6 d(P<0.01);41℃胁迫雌成螨3 h,其寿命显著缩短至5.0 d(P<0.001)。高温胁迫对雌成螨的生殖力也有明显影响,32、35、38及41℃分别胁迫雌成螨1 h,每雌产卵量显著下降为38.4、37.5、43.5和40.2粒(P<0.05);随着胁迫时间的延长,产卵量继续下降,38℃胁迫雌成螨3 h,产卵量为23.1粒(P<0.001),41℃胁迫雌成螨3 h,产卵量显著下降至7.8粒(P<0.001)。雌成螨分别在32、35、38及41℃下胁迫1 h,特定年龄存活率(lx)曲线均出现“平台期”,但38及41℃分别胁迫雌成螨3 h,lx曲线“平台期”消失;且随着温度升高及胁迫时间的延长,lx曲线坡度变陡。特定年龄生殖力(mx)曲线显示,高温胁迫促使产卵高峰期提前,mx下降;高温38及41℃分别胁迫雌成螨3 h,mx下降尤为明显。【结论】高温胁迫下,柑橘全爪螨雌成螨寿命缩短、lx下降、产卵数量减少及mx下降,且随着胁迫温度的升高和胁迫时间的延长,影响程度加剧,短时高温对雌成螨的存活和生殖有不利影响。夏季高温条件对柑橘全爪螨种群具有明显的抑制作用。
    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    粗糙集理论在土壤肥力评价指标权重确定中的应用
    叶回春1, 张世文2, 黄元仿1, 周志明1, 沈重阳1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  701-717.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.011
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    【目的】土壤肥力是土壤诸多基本特性的综合反映,科学、合理、实用地评价土地肥力将为指导农业生产、土地利用规划和管理提供理论依据。其评价过程是一个无决策属性的多属性决策过程,而解决多属性决策问题的重要前提是各属性权重分配问题。【方法】确定指标权重的方法主要有主观赋权法和客观赋权法,然而,主观赋权法往往需要大量的先验知识,评价结果有一定的主观随意性,而且较少考虑评价指标之间的依赖关系;客观赋权法没有充分考虑到各参评因素对评价的重要度不同,统计数据有相关性也并不意味着两个事件具有因果联系。综合考虑主、客观赋权法各自的优缺点,利用粗糙集理论中知识约简和相对正域理论在消除冗余信息和处理不确定性信息等方面的优势,探究土壤肥力评价过程中一种主观和客观相结合的权重确定方法,并利用作物产量对评价结果进行验证。【结果】粗糙集理论在土壤肥力评价中的具体赋权思路包括:数据的离散化、土壤肥力综合等级的初步确定、属性值约简、等价类划分、属性重要度的计算和指标权重计算等步骤。以北京大兴区农田土壤样点的肥力评价对上述赋权思路进行实例分析,对比传统特尔斐法和粗糙集理论赋权结果发现,特尔斐法确定的土壤有机质、全氮、有效磷和速效钾等指标的权重分别为0.300、0.250、0.250和0.200,利用其评价得到的土壤综合肥力指数(IFI)与产量显著线性相关,R2为0.77,均方根误差(RMSE)为1.25;而粗糙集理论确定的土壤有机质、全氮、有效磷和速效钾等指标的权重依次为0.455、0.111、0.111和0.333,利用其评价得到的IFI与产量也显著线性相关,R2达0.83,RMSE为1.09,精度均较特尔斐法有了提高,其中RMSE相对精度提高值达12.80%。【结论】粗糙集理论在土壤肥力评价中的具体赋权思路基本是可行的,且相对于特尔斐法其确定出各指标权重更为合理、准确,可为土壤肥力评价及相关领域的评价提供一个有益的思路。
    寒地稻田土壤氮素矿化特征的研究
    彭显龙1, 刘洋1, 于彩莲2, 王迪1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  702-709.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.010
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    【目的】土壤供氮能力是影响稻田氮效率的主要指标之一,寒地稻田与南方稻田相比具有氮肥用量低和氮素利用效率高的特点,通过比较南北方稻田土壤供氮能力的差异,以期揭示土壤氮素矿化与寒地稻田氮素高效利用的关系。【方法】选择江苏省高肥力的乌栅土和中等肥力勤沙土,以及黑龙江三江平原高中肥力白浆土型水稻土,采用淹水密闭培养法,在25℃、30℃和40℃条件下恒温培养28 d,测定培养前后土壤铵态氮的含量,并分析土壤有机质、全氮和有机氮各组分的含量;通过一级动力学模型和有效积温模型拟合土壤氮素矿化与培养时间的关系。【结果】南方高中肥力土壤酸解氮、氨基酸态氮占土壤全氮比例均高于北方高中肥力土壤,北方稻田土壤碳氮比较高。在25℃培养28 d,南方和北方高肥力土壤间,以及中等肥力土壤间累积矿化氮量无明显差异。当温度为40℃时,南方高肥力和中等肥力土壤28 d累积矿化氮显著高于对应肥力的北方土壤。这与南方土壤有机氮含量或者有机氮所占比例较高有关。One-pool模型拟合显示,在25℃时北方土壤矿化势(N0)比对应肥力南方土壤增加了35.9%—36.3%;当温度为30℃和40℃时,北方土壤与南方对应肥力土壤相比N0降低了6.1%—32.7%和20.9%—36.7%。北方土壤微生物不耐高温,是其40℃矿化势较低的原因。有效积温模型拟合显示,随温度增加同一土壤氮矿化特征常数n值逐渐减小;南方土壤的氮矿化特征常数K值较高,而北方土壤n值高,表示南方中高肥力土壤的初期矿化速率高,而北方中高肥力土壤后期矿化速率高。【结论】土壤矿化氮含量和矿化势受土壤微生物活性、土壤碳氮比、土壤有机氮含量及其占全氮的比例影响,25℃下北方稻田土壤可矿化氮量较高,而且相对南方稻田土壤而言,寒地稻田土壤氮素矿化前期较慢,后期较快的特点与水稻吸氮更协调,这是寒地稻田氮素高效利用的原因之一。
    园艺
    生姜种质遗传多样性和亲缘关系的SRAP分析
    李秀, 徐坤, 巩彪
    中国农业科学. 2014, 47(4):  718-726.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.012
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    【目的】生姜为无性繁殖作物,千百年来,在经历气候变迁、自然选择和人工选择过程中,其生物学性状呈现出多方面变异,造就了许多地方品种。因此,研究生姜种质资源的遗传多样性及亲缘关系,对生姜资源进行科学分类,为生姜种质的收集、保护和创新利用提供理论依据。【方法】采用CTAB法提取生姜幼叶基因组DNA,利用SRAP(相关序列扩增多态性,sequence-related amplified polymorphism)分子标记技术,对来源于世界不同地区的51份生姜种质的基因组DNA进行多态性扩增,PCR产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,采用银染法显色。根据电泳结果得到“0,1”矩阵,利用POPGENE version1.32软件计算每对引物的多态性位点数、多态性位点百分率,以及有效等位基因数Ne、Nei’s遗传相似系数(GS)、遗传距离(GD)、Nei’s遗传多样性指数、Shannon信息指数等指标,并采用NTSYS version2.10e软件进行种质间的UPGMA(非加权组平均法,unweighted pair-group method)聚类分析和基于Nei’s遗传距离的组群间的聚类分析,对生姜资源进行分类;同时,根据不同生态区之间生姜种质资源的遗传多样性和亲缘关系,结合植物起源中心相关特性及历史记载,探讨生姜的起源与传播。【结果】筛选出的15对引物共扩增出305条带,其中188条为多态性条带,多态性比率为61.68%,平均每对引物扩增出20.33个位点和12.53个多态性位点,说明生姜的遗传变异较为广泛。51份生姜种质的Nei’s遗传多样性指数、Shannon信息指数平均值分别为0.3689、0.5510,据此可将生姜种质分为3个大类、9个亚类,分析比较发现,每一类的生姜多来源于相同或相近区域。进一步研究表明,7个不同地理来源群体的Shannon信息指数范围是0.2901—0.4807,在遗传相似系数为0.9时,可将7个群体分为4类,华北群体、非洲群体各为一类,东南亚群体与日韩群体为一类,东南沿海群体、西南高原群体、华中群体为一类。【结论】品种间基于Nei’s遗传多样性指数和Shannon信息指数的分析表明,生姜虽为无性繁殖作物,但其遗传多样性较为丰富;根据遗传相似系数的UPGMA聚类分析结果,生姜种质资源的遗传多样性受地理来源影响较大;群体间遗传多样性分析表明,中国国内群体的遗传多样性高于国外群体,尤其华北群体与其他群体的遗传距离较远,且其栽培历史悠久,可以判定中国华北地区是生姜的次生起源地;而鉴于非洲群体的遗传多样性指数较高,与其他群体的遗传距离较远,且空间分布距中心位置较近,又有野生种存在,据此推断非洲可能是除东南亚之外的另一生姜原生起源地。
    ‘乔纳金’苹果及其脆肉芽变果实质地发育机理
    陈学森, 宋君, 高利平, 冀晓昊, 张宗营, 毛志泉, 张艳敏, 刘大亮, 张芮, 李敏
    中国农业科学. 2014, 47(4):  727-735.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.013
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    【目的】研究‘乔纳金’苹果及其脆肉芽变果实发育后期硬度与脆度的变化、果实香气成分含量以及果实软化相关基因的表达差异,旨在为全面认识该脆肉芽变的发育机理提供科学依据,并为进一步丰富苹果果实质地品质发育的理论体系提供基本资料。【方法】以‘乔纳金’苹果及其脆肉芽变苹果发育后期的果实为试材,检测果实硬度、脆度、香气成分含量以及乙烯生物合成基因ACO、ACS和果实软化有关基因PG、PME、β-Gal、α-L-Af、XET、AM、LOX及β-xyl的表达量。【结果】‘乔纳金’苹果及其脆肉芽变果实发育后期的果实硬度与脆度整体均呈下降趋势,其中在采前50-35 d有个快速下降过程,但脆肉芽变的果实硬度与脆度均显著高于‘乔纳金’;‘乔纳金’苹果酯类化合物的种类数与含量分别是其脆肉芽变的1.5倍和1.2倍,而醇类和醛类化合物含量分别仅是其脆肉芽变的15.1%和14.3%;‘乔纳金’苹果ACO基因表达量前后变化很大,在花后120 d有一个明显的表达峰,花后113-120 d表达量(2 995.8)占总表达量(3 039.6)的98.6%,而‘乔纳金’硬肉芽变果实ACS和ACO基因表达量前后变化不大,总表达量仅分别相当于‘乔纳金’的73.9%和1.1%,且表达峰均滞后于‘乔纳金’;‘乔纳金’苹果PG及XET等6个基因在花后113-120 d表达量均占总表达量的35%以上,是引起‘乔纳金’苹果果实硬度与脆度快速下降的主要原因,而‘乔纳金’脆肉芽变果实参试的12个基因总表达量(1 021.9)仅是‘乔纳金’(4 399.1)的23.2%,其中PG、α-L-Af、 XET和β-Gal等4个基因表达量分别是‘乔纳金’的12.5%、62.7%、72.6%和75.3%。【结论】‘乔纳金’苹果酯类成分种类多、含量高,而脆肉芽变醇类和醛类成分种类多、含量高;两份材料果实发育后期果实硬度和脆度的差异及其变化可能是ACS、ACO、PG、β-Gal、β-xyl、α-L-Af和 XET等多种基因协同作用的结果,其中ACO、PG、β-Gal和XET是关键基因。
    贮藏·保鲜·加工
    不同贮藏方式对赣南纽荷尔脐橙果实品质的影响
    何义仲1, 陈兆星1, 2, 刘润生1, 方贻文2, 古祖亮3, 严翔2, 陈红3, 张洪铭2, 唐焕庆3, 程运江1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  736-748.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.014
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    【目的】研究机械冷库(Mcs)、山区水冷贮藏库(Ecvs)和通风贮藏库(Vws)对赣南纽荷尔脐橙(Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’)果实的贮藏效果,为优化柑橘贮藏条件及贮藏库的改良提供理论依据。【方法】将商业成熟度的纽荷尔脐橙果实分别放置于3种不同类型的生产贮藏库,持续跟踪贮藏库的环境参数变化;运用气相色谱仪、红外线CO2分析仪等设备,分析贮藏果实的生理和生化指标,并进行感官评价。【结果】在贮藏期内,3种贮藏库内部环境参数持续变化,Mcs内部温度和相对湿度分别维持在2.1—11.2℃和64.4%—99.0%之间。随着气温升高,Mcs内部与运输或货架期环境的温差逐渐加大,与Vws、Ecvs存在显著差异。Vws与Ecvs内部温度和相对湿度的皮尔森系数分别达到0.80以上,变化趋势一致,但是,比较两种贮藏库相同时刻的温度和相对湿度,Ecvs延缓库内部温度升高,维持库内相对湿度的能力优于Vws。同时,Mcs内部CO2和乙烯浓度显著高于其他贮藏库。果实可滴定酸和可溶性固形物含量随着贮藏期的延长逐渐下降,而且果实可滴定酸比可溶性固形物下降更剧烈。在105 d(days of storage,DOS)后,Ecvs贮藏果实的可滴定酸含量显著高于Vws和Mcs贮藏果实,而果实可溶性固形物含量在各贮藏方式之间无显著性差异。果实的柠檬酸和苹果酸浓度在135 DOS显著下降,3种贮藏方式之间,果实柠檬酸和苹果酸的浓度存在差异,在65 DOS后,Ecvs贮藏果实柠檬酸和苹果酸浓度高于Mcs、Vws贮藏果实。在135 DOS前,Mcs维持果实硬度、可溶性糖、Vc效果明显优于Ecvs和Vws;但是在160 DOS,Mcs贮藏果实的硬度、可溶性糖和Vc损耗加剧,其含量显著低于Ecvs贮藏的果实。此外,果实的乙醇、乙醛、甲醇的浓度在105 DOS显著升高,3种贮藏方式之间,Mcs贮藏果实在160 DOS的乙醇积累量(723.02 μg•L-1)显著高于Ecvs、Vws贮藏果实,果实风味品质降低。Ecvs、Vws贮藏果实感官满意度随贮藏期延长不断波动,而Mcs贮藏果实感官满意度先升高后逐渐下降,在160 DOS显著低于Vws和Ecvs贮藏的果实。【结论】贮藏库与运输、货架期环境的温差,贮藏库内气体成份,尤其是乙烯,显著影响果实有机酸、乙醇、乙醛和甲醇的含量,导致不同贮藏库的果实品质和感官满意度的差异。Mcs贮藏果实在135 DOS品质出现劣变,Ecvs贮藏果实寿命可延长至160 DOS,而Vws贮藏果实品质在65 DOS后显著下降,不适于长期贮藏脐橙。
    氧化羊骨油对羊肉味调味基料挥发性风味物质的影响
    刘金凯1, 2, 高远1, 王振宇1, 陈丽1, 张德权1, 艾启俊2
    中国农业科学. 2014, 47(4):  749-758.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.015
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    【目的】确定添加适度氧化的羊骨油对热反应型羊肉味调味基料挥发性风味物质的影响,为高品质羊肉味调味基料风味的开发提供理论依据。【方法】评价以过氧化值、酸价和茴香胺值表征的氧化羊骨油对调味基料挥发性风味物质的影响,利用Pen3型电子鼻对不添加羊骨油、添加未氧化羊骨油和添加适度氧化羊骨油的3个热反应体系进行研究,以电子鼻主成分分析中的区分指数作为检测指标,确定3个热反应体系的区分度;应用固相微萃取-气质联用技术分离鉴定基料的挥发性风味物质,通过“相对气味活度值(ROAV)”评价各挥发性风味物质对调味基料总体风味的贡献,并结合聚类分析方法,确定添加氧化羊骨油后羊肉味调味基料的关键挥发性风味物质。【结果】电子鼻结果显示,未添加羊骨油与添加未氧化羊骨油的调味基料间区别指数为0.589,未添加羊骨油与添加氧化羊骨油的调味基料间区分指数为0.917,添加未氧化羊骨油与添加氧化羊骨油的调味基料间区分指数为0.787。气质联用结果显示,不添加羊骨油、添加未氧化羊骨油和添加适度氧化羊骨油的3组调味基料中挥发性风味物质的种类分别为42种、63种和61种,主要为醛类、烃类;在添加未氧化羊骨油组和添加氧化羊骨油组中,含硫、含氮杂环化合物的相对含量差异不显著,而对调味料风味改善贡献较小的烃类物质相对含量显著降低,同时醛类物质的相对含量显著增加,添加羊骨油尤其是氧化羊骨油可使热反应体系生成更多的醛类挥发性风味物质;确定3组调味基料中关键挥发性物质(ROAV≥1)有11种:辛醛、壬醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛、桃醛、庚醛、反-2-壬烯醛、十二醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、反,反-2,4-壬二烯醛,这些关键挥发性物质主要以脂肪香气为主,并包含甜香、青香、焦香和柑橘等香气;通过聚类分析将11种关键风味物质分为三类,第一类物质在添加氧化羊骨油后ROAV值变化较小;第二类包括反,反-2,4-癸二烯醛、反-2-壬烯醛,在添加氧化羊骨油后ROAV值显著增加;第三类为癸醛,在添加氧化羊骨油后ROAV值显著降低,而第二类与第三类物质在未添加羊骨油组和添加未氧化羊骨油组间的差异不显著(P >0.05)。【结论】添加氧化羊骨油,可以显著影响羊肉味调味基料挥发性风味物质的种类,增强热反应型羊肉味调味基料的风味,反,反-2,4-癸二烯醛与反-2-壬烯醛是改善调味基料最关键挥发性风味物质。
    畜牧·兽医·资源昆虫
    基于DGGE和T-RFLP分析采食不同粗饲料梅花鹿瘤胃细菌区系
    李志鹏1, 姜娜2, 刘晗璐1, 崔学哲1, 荆祎1, 杨福合1, 李光玉1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  759-768.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.016
    摘要 ( 260 )   HTML ( 1 )   PDF (710KB) ( 718 )   收藏
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    【目的】细菌区系在梅花鹿(Cervus nippon)瘤胃发酵中发挥着重要作用,然而有关梅花鹿瘤胃细菌区系的研究鲜有报道。研究梅花鹿瘤胃细菌区系,为梅花鹿瘤胃发酵调控提供分子生物学依据。【方法】选取4头2岁龄的装有永久性瘤胃瘘管的成年雄性梅花鹿为研究对象,分别饲喂以柞树叶(OL组,梅花鹿A和B)和玉米秸秆(CS组,梅花鹿C和D)为主要粗饲料的日粮,持续饲喂30 d。通过瘤胃瘘管取瘤胃内固液混合物,提取瘤胃微生物基因组DNA。扩增瘤胃细菌16S rRNA基因V3区以及16S rRNA基因,分别用于DGGE和T-RFLP分析。DGGE图谱进行聚类分析,并切取优势条带进行克隆测序,鉴定瘤胃内细菌组成。根据T-RFLP图谱结果计算细菌群落的多样性、优势度、均匀度和丰富度,通过Microbial Community AnalysisⅢ(MiCAⅢ)数据库推测T-RFs可能代表的微生物种类,并进行T-RFLP图谱的聚类分析。【结果】DGGE图谱聚类表明,CS组和OL组瘤胃细菌区系相似性低于65%,表明粗饲料种类影响梅花鹿瘤胃细菌区系。OL组梅花鹿A和B的DGGE图谱相似度大于70%,CS组梅花鹿C和D的DGGE图谱相似性大于75%,而且同组不同个体之间瘤胃细菌区系存在差异。OL组和CS组分别获得20和24个DGGE特异性条带。序列分析表明,CS组条带可归类为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门,而OL组条带可归类为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和互养菌门。OL组与CS组中存在大量Prevotella spp.,但不同组中Prevotella spp.在种水平组成不同,主要纤维降解菌为Clostridium spp.与Eubacterium spp.。T-RFLP结果显示,梅花鹿D(CS组)具有最高的丰富度、多样性、均匀度和最低的优势度,梅花鹿A和B的各项指数相近但低于梅花鹿D,说明OL组中的粗饲料(柞树叶)影响瘤胃中微生物的相对生物量。梅花鹿C和D的各项指数相差较大而且梅花鹿C的指数低于梅花鹿A和B,表明同组不同个体之间存在差异。81、214、272和308 bp的T-RFs为OL组优势条带,90、95、175、273和274 bp的T-RFs为CS组优势条带,161、259、264、266和284 bp的T-RFs为共同条带。根据MiCAⅢ结果,这些T-RFs代表细菌归类于拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和酸杆菌门。T-RFs图谱聚类表明,4头梅花鹿T-RFs聚为两类,粗饲料来源影响梅花鹿瘤胃细菌T-RFs图谱特征,其中梅花鹿A、B和C的T-RFs特征条带图谱相似。【结论】Prevotella spp.是梅花鹿瘤胃优势细菌,但不同粗饲料影响梅花鹿瘤胃细菌区系组成。
    人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染
    韩雪洁, 萨日娜, 梁浩, 李雪玲, 李荣凤
    中国农业科学. 2014, 47(4):  769-778.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.017
    摘要 ( 233 )   HTML ( 1 )   PDF (745KB) ( 522 )   收藏
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    【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor Ⅸ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。
    F4ac型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠 上皮细胞的免疫刺激作用
    周传丽1, 刘铮铸1, 2, 俞英1, 张勤1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  779-785.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.018
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    【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是一类世界范围内流行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知,F4ac型ETEC的流行性最为广泛。到目前为止,对ETEC导致仔猪腹泻的机理已经有了比较透彻的阐释。但对ETEC培养液的免疫原性尚未有研究和描述。论文以F4ac型ETEC为研究对象,探索其菌液上清(即培养液)对仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac型ETEC菌株200培养12h后的培养液,后经4℃,4 000 r/min,离心15 min收集培养液上清,将该上清液经0.22 µm滤器过滤,并与DMEM/F12培养基以1﹕1的比例混合,以此混合液共孵育IPEC-J2细胞3 h,重复此处理3次获得处理组细胞;同时设新鲜的LB培养基与DMEM/F12培养基同样以1﹕1的比例共孵育3 h的IPEC-J2 细胞为对照组细胞,对照处理亦重复3次。然后用TRIZOL试剂按照说明书提取对照组和攻毒组IPEC-J2细胞的总RNA,并用TaKaRa 公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(反转录试剂盒)按照说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。应用文献报道或自行设计的跨内含子的引物通过实时荧光定量PCR方法,以猪的持家基因β-actin作为内参,检测IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13共9个免疫相关基因和黏蛋白基因在攻毒组和对照组中的mRNA表达差异性。【结果】较之对照组,在攻毒组中,3个重要的促炎细胞因子基因IL8、TNF-α和CXCL2的mRNA均出现了显著性地过表达。其中,在攻毒组中,IL8的表达量为对照组的3.24倍(P < 0.05);TNF-α的表达量亦为对照组的3.24倍(P < 0.01);CXCL2 的表达量为对照组的1.65倍(P <0.001)。在攻毒组和对照组之间,其他6个基因(IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13)的表达差异未达到统计学上的显著水平。【结论】研究采用F4ac型ETEC菌株200的培养液上清对IPEC-J2细胞系进行3 h攻毒处理,并通过荧光定量PCR方法检测到了3个重要的促炎因子基因IL8、TNF-α和CXCL2在攻毒组较之非攻毒组中的过表达。这表明猪F4ac型ETEC培养液上清对仔猪小肠上皮细胞确实具有一定的免疫刺激作用。研究为更明确地了解猪F4ac型ETEC释放的肠毒素及黏附素等抗原物质对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用提供了一定的实验证据。
    农业经济与管理
    耕地资源非农化价值损失评价模型与补偿机制研究
    任平, 吴涛, 周介铭
    中国农业科学. 2014, 47(4):  786-795.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.019
    摘要 ( 208 )   HTML ( 1 )   PDF (614KB) ( 423 )   收藏
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    【目的】耕地资源生态价值和社会价值长期被忽视是我国耕地保护中最大的不足和缺陷,耕地非农化价值损失远远超过传统意义上的经济价值损失。耕地资源流失、非农化的核心问题之一是对耕地资源非农化价值理论认知的缺失,是对耕地资源(保护)非农化价值构成、体系、方法等科学问题研究还不够透彻、不够深入,这是必须认识到的一个基础理论问题。通过构建耕地价值评价方法与模型,实现耕地资源(保护)非农化价值损失定量评价与模拟,以期为耕地保护、耕地补偿决策等提供理论和实践参考。【方法】以耕地资源价值分类为基础,运用收益还原法、等效替代法、市场价值法构建耕地资源经济价值、社会价值和生态服务价值综合评价模型。耕地资源经济价值主要通过修正不同农作物的收益差异权重指数,运用收益还原法计算经济价值;耕地资源社会价值主要运用等效替代法计算,其中采用城镇养老保险金修正参数代替基本保障价值,用农民农业生产效益参数代替农民就业工资水平,用区域粮食供需差额参数代替社会稳定价值;耕地资源生态服务价值在修正单位耕地面积生态当量因子的基础上,考虑生态服务当量因子的经济价值与平均粮食单产市场价值的相关关系,运用市场价值法进行计算。【结果】(1)评价模型客观地还原了耕地资源货币化价值,具有一定的可行性和科学性,并可以实现不同区域耕地价值的评价与模拟,具有较强的通用性和适用性。(2)实证研究表明,四川省耕地资源保护价值为122.85万元/hm2,其中经济价值、社会价值与生态服务价值分别占5.74%、64.17%、30.09%。(3)以2010年为基准年,四川省耕地资源保护价值为82 555.20亿元,是四川省当年GDP的4.8倍,耕地非农化价值损失量为436.12亿元,为当年GDP的2.5%。【结论】(1)耕地(保护)非农化利益主体的微观响应表明,中央政府不能被排除在耕地资源(保护)非农化价值损失补偿之外,其应该承担耕地保护的生态服务价值和社会稳定价值,并以此为基础建立耕地保护基金提供给耕地保护者,地方政府和非农用地企业要承担耕地非农化损失全部价值补偿。(2)耕地资源价值具有较强的区域性差异性,建立耕地价值评价和修正体系是今后需要解决的重要技术问题之一。(3)该评价方法和结果可用于耕地资源非农化价值损失评价实践,研究结果为中央政府应承担耕地保护基金提供了理论依据,为具体补偿标准制定提供了技术支撑,为耕地补偿机制建立提供了一个新的视角,有助于改变传统耕地保护模式并建立耕地保护补偿新机制。
    基于种业市场份额的中国种业国际竞争力分析
    王磊, 刘丽军, 宋敏
    中国农业科学. 2014, 47(4):  796-805.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.020
    摘要 ( 262 )   HTML ( 1 )   PDF (659KB) ( 1038 )   收藏
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    【目的】种业是国家战略性、基础性核心产业,中国巨大的种业市场正成为主要跨国公司竞争的焦点。种业竞争力不仅决定种业自身发展,而且也决定农业产业安全,不断提升种业竞争力是保障现代农业持续健康发展和国家粮食安全的根本。随着经济全球化、全球市场一体化进程的加快,市场份额竞争成为现代种业国际竞争的焦点,因此,从种业市场份额角度开展中国种业国际竞争力研究,以期全面、准确、科学的认识中国种业国际竞争力水平。【方法】运用国际种子联盟(ISF)、世界贸易组织(WTO)以及中国海关统计资讯室发布的相关数据,利用统计分析与显示性比较优势指数(RCA)、出口质量升级指数(QC)等常用市场份额分析指数对中国种业国际竞争力进行描述性与实证分析。【结果】中国虽然拥有世界上第二大的种子市场(2012年为99.50亿美元,仅次于美国120亿美元),但在全球种子市场份额竞争中,得到的国外市场份额少,失去的国内市场份额多;出口市场主要集中在亚洲(59.04%),而种子大额市场非洲(0.83%)和南美洲(0.18%)等占据的份额较少;竞争优势品种缺乏,相对来说,目前蔬菜与水稻种子占有的市场份额较多,均在1亿美元左右,而全球种子市场需求旺盛的小麦、玉米、大豆等种子占据的市场份额较少,均不到0.01亿美元。整体来看中国种业国际竞争力较差。从RCA计算结果来看,中国种业RCA指数较低且远小于评价标准值0.8,与美国、荷兰等种业强国相比还有很大差距,中国种业不具备显示性比较优势,种业国际竞争力较差但竞争力上升趋势明显,相对来说,蔬菜品种竞争力要高于农作物品种;从QC计算结果来看,中国种业种子出口质量升级指数大于评价标准值1且高于美、荷等种业强国,出口的各类型种子除小麦种子与大豆种子外其余种子附加值均相对较高,其中,2011年蔬菜种子QC值甚至达到了4.86,远高于判定标准值1,中国种业种子产品具有一定的质量竞争优势。【结论】中国种业在国际市场份额竞争中处于弱势地位,不具有显示性比较优势,出口市场集中且品种类型单一,竞争力较弱但整体处于上升态势;种业产品除小麦、大豆外,水稻、玉米、油菜、向日葵、甜菜、棉花、草本花卉植物、瓜果、蔬菜及牧草等作物种子目前附加值均较高,中国种业种子产品具有质量竞争力且各类型种子质量上升趋势明显,中国种业应注重以此为契机加速提升和巩固种业市场份额的拓展和掌控能力,以便应对日益激烈的国际种业市场份额竞争。
    研究简报
    亚洲璃眼蜱不同发育阶段及其组织中microRNA-10表达分析
    袁小松1, 2, 罗金1, 田占成1, 谢俊仁1, 王芳芳1, 田美媛1, 张以芳2, 刘光远1
    中国农业科学. 2014, 47(4):  806-813.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.021
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    【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度为20—22个核苷酸(nt)且高度保守的非编码小RNA。迄今为止,在病毒、动物、植物中都有发现,如在Mareks病毒、果蝇、斑马鱼、人类以及拟南芥等多种生物中都有存在。其通过与靶基因特异性的碱基互补配对使靶基因降解或者受到抑制,在转录后水平调控靶基因的表达水平。miRNAs参与多种生物的细胞增殖、分化、代谢与死亡等多种生物学过程。为了解microRNA-10在亚洲璃眼蜱中的潜在生物学功能,试验获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体、成熟体序列;分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达水平,及亚洲璃眼蜱miR-10的生物学意义;为进一步研究miR-10与亚洲璃眼蜱生长发育间的关系奠定基础。【方法】用Trizol Reagent分别提取不同发育阶段及组织的总RNA,用SYBR ®Prime Script TMmiRNA RT-PCR Kit( TaKaRa Code: RR716) 制备cDNA。参考miRBase数据库中isc-miR-10(登录号:MI0012262)序列,设计特异性引物,通过PCR的方法从亚洲璃眼蜱中扩增获得miR-10前体序列,通过MEGA4软件将此前体序列与已知物种的miR-10前体序列进行比对分析;利用qPCR技术分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达情况;推测miR-10在亚洲璃眼蜱中的生物学功能。【结果】获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体序列CUACAUCUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUUUGCCACUAGACUACAAAUUCGGUUCUAGAGAGGCUUUGUGUGG,大小为73bp;亚洲璃眼蜱的miR-10前体序列与肩突硬蜱的相似性最高,是95.9%,且与其他节肢动物相似性在88.9%—91.7%之间;miR-10在不同物种间高度保守。miR-10的成熟体序列为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU,种子序列为ACCCUGU。在亚洲璃眼蜱的不同发育阶段中,饥饿若蜱的miR-10的表达水平最高,是卵的48.3倍;饥饿成蜱是卵的7.78倍;饥饿幼蜱是卵的2.78倍。在饥饿雌性成蜱吸血过程中,吸血3d的成蜱是饥饿成蜱的约4.28倍,吸血5d的成蜱是饥饿成蜱的约0.31倍,饱血自然脱落的成蜱是饥饿成蜱的约0.087倍。吸血初期miR-10的表达量上调,随着吸血时间的延长其表达量逐渐下调;在唾液腺、气管、卵巢、表皮、中肠中miR-10的表达情况有明显不同,其中唾液腺的表达量最高,是表皮的13.2倍;卵巢的表达量是表皮的2.98倍,气管的表达量是表皮的6.46倍。【结论】从亚洲璃眼蜱中克隆miR-10序列,序列分析显示此序列在节肢动物中相对保守。miR-10在亚洲璃眼蜱不同发育阶段及不同组织的表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR-10表达的差异性及已报道miR涉及的生物学功能,推测miR-10在亚洲璃眼蜱的细胞增殖、发育及吸血方面有潜在的重要作用。本研究为寄生虫miRNAs功能的研究提供一定的依据,并有可能为防控寄生虫疾病开辟新的途径。
    伊拉兔宰后肌糖原变化及其与兔肉品质的相关性
    薛山, 贺稚非, 李洪军
    中国农业科学. 2014, 47(4):  814-822.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.022
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    【目的】探讨伊拉兔宰后36 h内肌糖原变化规律及与肉品品质变化的相关性。【方法】伊拉兔经屠宰之后,肌肉内的糖原会在一定时间内酵解转化为乳酸,从而改变胴体的pH值,并进一步影响肉品的持水力、剪切力、肉色等品质指标。以伊拉兔背最长肌(LD)和左后腿肌(LL)为原料,用试剂盒法分别测定了伊拉兔宰后45 min、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h肌糖原含量的变化,并对兔宰后相应时间点的肉品品质指标如pH值、蒸煮损失、滴水损失、剪切力、色泽变化进行了检测与分析。此外,将主要设计因子(pH、蒸煮损失、滴水损失、总损失、剪切力、L*、a*、b*、C*)作为X变量,以肌糖原的含量作为Y变量,用偏最小二乘回归分析法(PLS2)对伊拉兔宰后LD和LL肉品品质与肌糖原变化规律的相关性进行探讨。【结果】伊拉兔宰后36 h内部位LD和LL的肌糖原含量均下降显著(P<0.05),二者分别从屠宰初期的(2.61±0.50)mg•g-1和(2.77±0.55)mg•g-1减少为宰后36 h的(0.94±0.05)mg•g-1和(0.99±0.07)mg•g-1。与此同时,伊拉兔LD和LL的pH分别从宰后初期的(6.91±0.02)和(6.85±0.04)下降至(5.62±0.09)和(5.61±0.09)。在此期间,随着pH的下降,伊拉兔肉品品质指标也发生了相应地改变,如剪切力、亮度L*值、红度a*值降低;蒸煮损失、滴水损失、总损失、b*值和C*值升高。PLS2分析显示,以上各肉品品质指标与兔宰后肌糖原含量变化的相关性均较大,部位LD和LL的回归系数R值分别达0.796—0.972和0.890—0.996。其中,2个部位的总损失指标(蒸煮损失与滴水损失之和)较其他肉品品质的差异来源更为显著。此外,可以用以上兔肉宰后品质指标为自变量,运用Unscrambler建立回归方程对肌糖原变化评分较好地进行预测。【结论】伊拉兔宰后36 h内肌糖原下降显著,与其间肉品品质的变化密切相关,可利用其酵解规律与各品质指标的相关性建立回归方程,从而对肌糖原含量变化进行较好地预测。